hrvatski

Usporedba kvalitete RNA izolirane iz tkiva kalifornijske pastrve (Oncorhynchus Mykiss) pripremljenog na 4 razlicita nacina

Brza i precizna dijagnostika bolesti riba u uzgoju je važna radi pravovremenog sprečavanja velikih gubitaka. Tehnike molekularne biologije stoga nalaze veliku primjenu u području akvakulture. Prvi korak u takvim istraživanjima je izolacija DNA ili RNA. Priprema tkiva za izolaciju RNA koja će poslužiti za daljnju analizu RT-PCR-om (reverzna transkripcija-lančana reakcija polimerazom) je ključni korak o kojem ovisi cijeli postupak analize. Svrha našeg istraživanja je bila usporediti kvalitetu i integritet RNA molekula izoliranih iz tkiva kalifornijske pastrve pripremljenog na 4 načina: svježe tkivo, smrznuto tkivo, tkivo fiksirano u metakarnu i uklopljeno u parafin i tkivo fiksirano u formalinu i uklopljeno u parafin. Izolirana RNA je analizirana elektroforetski na 1%-tnom, nedenaturirajućem agaroznom gelu. Njena kvaliteta i integritet su provjereni u RT-PCR reakciji s početnicama za β -aktin. Dodatno je provjerena i prisutnost virusa virusne hemoragične septikemije (VHS) i infektivne hematopoetske nekroze (IHN) iz ovako obrađenog tkiva u RT-PCR reakciji s početnicama specifičnim za ove viruse. Visoku kvalitetu, integritet i količinu imala je RNA izolirana iz svježeg i smrznutog tkiva. RNA izolirana iz tkiva fiksiranog u metakarnu i uklopljenog u parafin je bila degradirana, ali je dala očekivane produkte u reakciji RT-PCR s početnicama za β -aktin. Ovakvi produkti reakcije RT-PCR nisu dobiveni kada je korištena RNA izolirana iz tkiva riba fiksiranog u formalinu i uklopljenog u parafin, što je u skladu s literaturnim podacima o agresivnom djelovanju formalina kao fiksatora na RNA u tkivu. Pregledane ribe nisu bile zaražene virusima VHSV i IHNV, što je bilo u skladu s anamnezom te kliničkim, patološko-anatomskim pregledom. Prema našim saznanjima, ovo je prva uspješna izolacija RNA iz tkiva riba fiksiranog u metakarnu i uklopljenog u parafin, a koja se dalje može koristiti u analizi RT-PCR. Metoda je jednostavna i relativno jeftina, a tkivo uklopljeno u parafin može se čuvati godinama, te se može upotrijebiti kako za detekciju patogena (virusa), tako i za analizu genske ekspresije na razini mRNA.

kalifornijska pastrva; metakarn; izolacija RNA; RT-PCR; VHSV; IHNV

nije evidentirano