hrvatski

Metil-transferaza NpmA: kloniranje gena u ekspresijski vektor, ekspresija i imunokemijska detekcija rekombinantnog proteina

Jedan od mehanizama rezistencije koji su bakterije razvile prema aminoglikozidnim antibioticima jest modifikacija ciljnog mjesta djelovanja putem 16S rRNA metil-transferaza. Taj mehanizam razvio se najprije u bakterijama koje su prirodni proizvođači antibiotika, a nedavno je nađen i u patogenim sojevima. Poznata su dva mjesta djelovanja takvih enzima: N7 gvanina na položaju 1405 i N1 adenina na položaju 1408. NpmA prva je 16S rRNA metil-transferaza izolirana iz patogenog soja Escherichia coli ARS3 koja metilira adenin na položaju 1408 te pruža rezistenciju na široki spektar aminoglikozidnih antibiotika. Gen npmA rekloniran je iz vektora pBSK u ekspresijski vektor pET-25b(+). Rekombinantni vektor pET-25b(+)-npmA unijet je potom u ekspresijski soj E. coli BL21(DE3)pLysS. Ekspresija proteina potaknuta je dodatkom IPTG u bakterijsku kulturu i optimirana tako da udio topljivog proteina bude što veći, što je postignuto indukcijom na 37°C pri koncentraciji induktora IPTG od 1 mM u kulturi kojoj OD600 iznosi od 0, 6 do 0, 8. Tako dobiven protein NpmA nalazi se sav u topljivom obliku. Najveća količina proteina NpmA dobiva se 3 sata nakon početka indukcije. Rekombinantni protein detektiran je metodom Western blot uz korištenje monoklonskog protutijela razvijenog naspram afinitetne oznake od više uzastopnih histidinskih ostataka. Rad predstavlja nužni korak koji prethodi kinetičkim ispitivanjima mehanizma djelovanja i određivanju strukture NpmA, što će omogućiti razvoj inhibitora ovog enzima te novih antibakterijskih lijekova koji zaobilaze ovaj mehanizam otpornosti.

aminoglikozidni antibiotici; kloniranje; detekcija; ekspresija; NpmA; otpornost

nije evidentirano