Metil-transferaza ErmC': kloniranje i ekspresija gena i pročišćavanje proteina (CROSBI ID 330865)
Ocjenski rad | magistarski rad (mr. sc. i mr. art.)
Podaci o odgovornosti
Maravić, Gordana
Flögel, Mirna
hrvatski
Metil-transferaza ErmC': kloniranje i ekspresija gena i pročišćavanje proteina
Bakterijska rezistencija na antibiotike skupine makrolid-linkozamid-streptogramin B temelji se na djelovanju niza metil-transferaza iz obitelji Erm koje jednostrukom ili dvostrukom metilacijom specifičnog adenina unutar 23 S rRNA sprečavaju vezanje antibiotika na ribosom. Za istraživanje je odabrana metil-transferaza ErmC, jedan od biokemijski stabilnijih pripadnika Erm skupine enzima. Gen ermC izoliran je i umnožen iz prirodnog plazmida pIM13 bakterije Bacillus subtilis BD1167 u lančanoj reakciji polimerazom. Istovremeno su na krajeve gena uvedena restrikcijska mjesta koja su omogućila njegovo kloniranje u ekspresijski vektor pET-25b(+). Rekombinantni vektor pET-25b(+)/ermC unijet je u ekspresijski soj E. coli BL21(DE3)pLysS. Ekspresija proteina potaknuta je dodatkom IPTG u bakterijsku kulturu i optimirana tako da udio topljivog proteina bude što veći. Iskušavanjem niza kromatografskih metoda utvrđen je optimalni postupak pročišćavanja metil-transferaze ErmC iz proteinskog ekstrakta bakterija. Metoda uključuje dva koraka pročišćavanja na kationskom izmjenjivaču pri čemu je protein u prvom koraku eluiran stupnjevitim koncentracijskim gradijentom NaCl, a u drugom linearnim koncentracijskim gradijentom NaCl. Opisanim postupkom dobiva se protein vrlo visoke čistoće uz dobru učinkovitost. Raspravljena su buduća istraživanja od kojih se očekuje rasvjetljavanje katalitičkog djelovanja i strukture aktivnog centra metil-transferaze ErmC.
ErmC'; ekspresija; kloniranje; MLS antibiotici; otpornost; pročišćavanje
nije evidentirano
engleski
Methyltransferase ErmC': gene cloning and expression and protein purification
nije evidentirano
cloning; ErmC'; expression; MLS antibiotics; purification; resistance
nije evidentirano
Podaci o izdanju
87
14.04.2000.
obranjeno
Podaci o ustanovi koja je dodijelila akademski stupanj
Prirodoslovno-matematički fakultet, Zagreb
Zagreb