hrvatski

Optimiranje postupka transfekcije za metodu visokog probira pri virusnoj infekciji

Virusi su savršeno prilagođeni patogeni koji ovise u potpunosti o domaćinskoj stanici. Jedini način na koji možemo shvatiti kako virusi iskorištavaju različite stanične procese jest da opišemo stanične puteve prijenosa signala i fiziološke procese koji se odvijaju tokom virusne infekcije, a o tome se još uvijek malo zna. Da bismo proširili spoznaje u tom području potreban je novi pristup u istraživanju, takozvani sistemski pristup, koji uključuje istovremenu analizu velikog broja uzoraka. Stoga je cilj rada bio optimirati protokol transfekcije stanične linije HeLa Ohio za metodu visokog probira koja koristi mikrotitarske ploče s 96 bunarića i omogućava brzo ispitivanje velikog broja parametara staničnih procesa tokom virusne infekcije. Pri optimiranju metode vektor pEGFP-C1 koji kodira zeleni fluorescentni protein unošen je u stanicu „ reverznom“ transfekcijom koja se pokazala puno jednostavnijom, bržom i manje toksičnom za stanice u odnosu na „ klasičnu“ transfekciju. Postupak transfekcije je optimiran korištenjem nekoliko različitih transfekcijskih reagensa od kojih se najučinkovitijim pokazao Turbofect. Nakon ekspresije zelenog fluorescentnog proteina stanice su inficirane ljudskim rinovirusom 14. Za promatranje stanica u bunarima korišten je potpuno automatizirani epifluorescentni mikroskop koji istovremeno daje informaciju o brojnim fenotipovima. Valjanost metode je potvrđena proučavanjem poznate uloge dinamina u infekciji s ljudskim rinovirusom 14. Nakon toga metoda je primijenjena na ispitivanje uloge proteina rab5 u infekciji ljudskim rinovirusom 14. Uočeno je da rab5 ima ulogu pri infekciji i stoga je zaključeno da virus ulazi u rane endosome.

transfekcija; metoda visokog probira; rinovirusi; dinamin; rab5

nije evidentirano