hrvatski

Pročišćavanje protutijela razvijenog naspram galektina-3

Galektini su pripadnici porodice lektina - fizioloških receptora glikana koji specifično prepoznaju i vežu β -galaktozidne jedinice glikana. Glikani su biopolimeri sa velikom raznolikošću u građi, što ih čini pogodnim molekulama za pohranu bioloških informacija. Galektin-3 je strukturno jedinstveni član galektinske porodice jer u dodatku CRD (carbohydrate recognition domain), domeni koja prepoznaje ugljikohidrate, sadrži prolinom i glicinom bogatu N-terminalnu domenu, pomoću koje može stvarati oligomere. Kroz specifične interakcije s izvanstaničnim i unutarstaničnim proteinima, galektin-3 sudjeluje u adheziji stanica, staničnom signaliziranju, imunološkim reakcijama i razvoju tumora. Cilj ovog rada bio je pročistiti monoklonsko protutijelo koje u medij izlučuju stanice TIB-166ᵀ ᴹ (izvorno dobivene fuzijom štakorskih B-limfocita i mišjih mijeloma stanica) za potrebe kvantitativne ELISA metode. Kultiviranjem u mediju RPMI/ 10 % FCS stanice TIB-166ᵀ ᴹ dobro rastu, no protutijelo na galektin-3 dobiveno iz supernatanta medija potrebno je dodatno pročistiti afinitetnom kromatografijom. Da bi se izbjeglo to dugotrajno i zahtjevno pročišćavanje, potrebno je stanice TIB-166ᵀ ᴹ nasaditi u hibridoma medij, u kojem one sporije rastu, ali protutijela dobivena iz supernatanta medija ne sadrže dodatne proteine. U ovom radu je opisano kako su stanice TIB-166ᵀ ᴹ prebačene iz bogatog medija RPMI/ 10% FCS u medij bez proteina (hibridoma medij). Supernatant TIB-166ᵀ ᴹ stanica analiziran je SDS-PAG elektroforezom te su rezultati pokazali da protutijelo sadrži samo malo dodatnih proteina, no oni su prisutni i kod komercijalno nabavljenog IgG. Western blot analiza pokazala je kako je pročišćeno protutijelo fukcionalno u smislu da ga prepoznaje sekundarno protutijelo i u smislu da prepoznaje svoj ligand te se može koristiti za imunokemijske analize. Za pročišćavanje veće količine protutijela bilo je potrebno odrediti optimalne uvjete kultiviranja TIB-166ᵀ ᴹ stanica u hibridoma mediju. Stoga su one nasađene u različitim početnim koncentracijama (5 x 〖 10〗 ^5 st/ ml i 10 x 〖 10〗 ^5 st/ ml) te je analiziran supernatant nakon 3, 5, 7, 10, 12 i 14 dana kultiviranja. Rezultati su pokazali da su početna koncentracija 5 x 〖 10〗 ^5 st/ ml i vrijeme kultiviranja od 10 dana pogodni uvjeti za dobivanje veće količine pročišćenog protutijela. U tim uvjetima, stanice TIB 166ᵀ ᴹ su kultivirane 10 dana u 500 ml hibridoma medija, supernatant je analiziran metodama SDS-PAG elektroforezom i Western blot. Rezultati su pokazali da je pročišćeno protutijelo funkcionalno te je supernatant profiltriran, ukoncentriran i liofiliziran.

galektin-3; protutijelo; pročišćavanje

nije evidentirano