hrvatski

Izolacija i karakterizacija lizosoma u stanicama CHOwt i CHO NPC1-null

Bolest Niemann-Pick tip C (NPC) je lizosomska bolest nakupljanja koju uzrokuju mutacije u genima NPC1 ili NPC2. Uslijed gubitka funkcije proteina Npc1 ili Npc2 dolazi do nakupljanja neesterificiranog kolesterola u kasnim endosomima/lizosomima. Cilj ovog diplomskog rada bio je razviti metodu izolacije lizosoma iz CHOwt i NPC1-null stanica, staničnog modela NPC bolesti, pomoću paramagnetičnih nanočestica željeznog oksida vezanih na dekstran kako bi se omogućila njihova karakterizacija. Stanice su inkubirane u mediju koji sadrži ove nanočestice. Lizosomi su izdvojeni iz staničnog lizata djelovanjem vanjskog magnetnog polja, a čistoća dobivenih frakcija lizosoma analizirana je metodom western blot. Iz ovih frakcija membranski proteini lizosoma izdvojeni su upotrebom Tritona X-114. N-glikani su odvojeni od membranskih glikoproteina djelovanjem enzima peptid-N4-(N-acetil-beta-glucosaminil)asparagin-amidaze (PNGaze), pročišćeni su i analizirani pomoću tekućinske kromatografije visoke djelotvornosti (UPLC). Ovom metodom izolirali smo lizosome visoke čistoće, jer dobivene frakcije nisu dale pozitivan signal za rane/kasne i reciklirajuće endosome. No, primijetili smo smanjenu efikasnost izolacije lizosoma iz stanica NPC1-null u odnosu na CHOwt. Pratili smo transport fluoresceinom obilježenog dekstrana unutar stanica. Oba tipa stanica su unijela podjednaku količinu dekstrana, ali se u CHOwt stanicama nakon 6h inkubacije stvaraju agregati ovog fluoresceinom obilježenog dekstrana, dok se u NPC1-null stanicama njegov signal gubi. Nadalje, postoje razlike u N-glikanima između NPC1-null i CHOwt stanica te bi bilo zanimljivo nastaviti njihovo istraživanje.

lizosomi; Niemann-Pick tip C; glikani

nije evidentirano