hrvatski

Endocitoza i vezikularni transport MHC molekula I. razreda

Cilj istraživanja: Istraživanja koja se opisuju u ovom radu vezana su za uspostavljanje modela za izučavanje spontane endocitoze MHC molekula I. razreda na nepolariziranim neadherentnim stanicama P815 i adherentnim stanicama L-L(d) i MEF. Nadalje, željeli smo utvrditi način na koji se ta endocitoza odvija, te odrediti dinamiku i međusobni odnos između različitih konformacija molekula L(d), kako unutar stanice, tako i na njezinoj površini. Materijali i metode: Spontanu endocitozu na ispitivanim staničnim linijama, izazvali smo cikloheksimidom (CHX), inhibitorom proteinske sinteze, čime smo spriječili dolazak novosintetiziranih molekula na staničnu površinu. Uz njega smo koristili i različite kemijske inhibitore endocitoze, vezikularnog transporta i staničnog signaliranja, te uz pomoć monoklonskih protutijela MA-215 i SF-1.1.1. (molekule K(d)), 34-5-8S (molekule D(d)), 30-5-7 (pune molekule L(d)) i 64-3-7 (prazne molekule L(d)) površinsku izraženost MHC molekula I. razreda pratili protočnom citometrijom. Nadalje, u cilju identifikacije unutarstaničnog puta površinskih glikoproteina vezali smo na njih biotin, a obilježene molekule nakon određenog vremena pratili imunoprecipitacijom i kemiluminiscencijom. Oponašanjem uvjeta endosomalnog pH izvan stanice, utvrdili smo međusoban odnos punih i praznih molekula Ld, odnosno promjenu njihove konformacije u zadanim uvjetima. Rezultati: CHX je uspješno inhibirao dotok novih molekula na staničnu površinu uz zadovoljavajuću vijabilnost tijekom 24 sata, ne ometajući tijek normalne endocitoze. Molekule K(d) i D(d) se uklanjaju sa površine stanica P815 sa poluživotom od 15-18 sati (K(d)), odnosno više od 24 sata (D(d)), dok se molekule L(d) sa iste stanične linije uklanjaju brže i njihov poluživot na staničnoj površini iznosi oko 6-10 sati. Usporedbom internalizacije molekula L(d) na staničnim linijama P815 i L-L(d) ustanovili smo slično poluvrijeme izražaja na staničnoj površini, uz napomenu da se prazne molekule L(d) ipak zadržavaju dulje na fibroblastima L-L(d), a pune se brže degradiraju na istoj staničnoj liniji u usporedbi sa stanicama mastocitoma. Na stanicama MEF sve molekule H2(d) se stabilno izražavaju tijekom 10-12 sati (oko 80% početne površinske izraženosti), te se stoga u tom vremenu najvjerojatnije recikliraju, no, degradiraju se tijekom narednih 12 sati (na vrijednost manju od 50% početne površinske izraženosti). Na stanicama P815 i L-L(d) prazne molekule L(d) se endocitiraju kaveolarnom endocitozom, a pune molekule zasad nepoznatim mehanizmom. Inhibitori endosomalnog zakiseljavanja povećavaju površinsku i ukupnu izraženost praznih molekula L(d), a nakon 20 sati smanjuju ukupnu izraženost punih molekula. Primjenom kiselog pH (5.5 &#8211 ; ; 6.0) na staničnoj površini, ustanovili smo da niži pH povećava izražaj praznih molekula L(d), dok razmjerno i reverzibilno smanjuje izražaj punih molekula L(d). Zaključak: Primjenom CHX uspostavili smo model praćenja spontane endocitoze, odnosno uklanjanja MHC molekula I. razreda sa stanične površine. Na taj način smo utvrdili da njihova internalizacija može ovisiti kako o njihovoj stabilnosti, tako i o staničnoj liniji na kojoj se vrši ispitivanje, no, najčešće je posljedica zajedničkog učinka ovih dvaju parametara. Nadalje, molekule L(d) se internaliziraju različitim mehanizmima ovisno o konformaciji. Osim toga, mogu reverzibilno prelaziti iz jedne konformacije u drugu na način koji je ovisan o pH i ostalim uvjetima okoliša (b2-mikroglobulin, egzogeni peptidi, chaperoni i sl.).

endocitoza; klatrinska endocitoza; kaveolarna endocitoza; endosomi; vezikularni transport; inhibitori endocitoze i vezikularnog transporta; MHC molekule I. razreda; molekule L(d); konformacije molekula L(d)

nije evidentirano