hrvatski

Endocitoza virusa i površinskih glikoproteina

Cilj istraživanja: Cilj nam je bio utvrditi način na koji MCMV ulazi u stanicu domaćina, karakterizirati mehanizam transporta virusne DNA u staničnu jezgru, ispitati ulogu motornog proteina dineina i uloge citoskelata u okviru transportnog sustava, te mehanizme fosforilacije vezane uz navedene procese. Pokušali smo utvrditi mehanizam virusom inducirane endocitoze MHC molekula I. razreda i utvrditi njihovu sudbinu nakon internalizacije. Materijali i metode: Ulazak MCMV u stanicu pratili smo na mišjim embrionalnim fibroblastima metodom indirektne imunofluorescencije (izraženost IE1 i E1 proteina u staničnoj jezgri), imunoprecipitacijom i metodom Western-blota. Učinak infekcije na internalizaciju MHC molekula I. razreda, kao i izraženost membranskih proteina pratili smo protočnom citometrijom i imunoprecipitacijom, a unutarstaničnih proteina imunofluorescentnom mikroskopijom. Lokalizaciju glikoproteina u unutarstaničnim odjeljcima, te njihove modifikacije i promjene konformacije, pratili smo metodom imunoprecipitacije, elektroforezom i prikazali kemiluminiscencijom. Membranske glikoproteine obilježavali smo metodom površinske biotinilacije prema postupku razvijenom u našem laboratoriju. U cilju karakterizacije endocitoznog puta virusnih proteina koristili smo inhibitore endocitoze, vezikularnog transporta i staničnog signaliranja. Rezultati: Izražaj IE1, neposrednog ranog (engl. immediate-early) i E1, ranog (engl. early) virusnog proteina u staničnoj jezgri može se primjeniti kao pokazatelj infekcije. Virus obilježen biotinom nije dobar model praćenja njegovog ulaska u stanicu obzirom da površinska biotinilacija mijenja njegova funkcionalna svojstva. Inhibitorima poznatih mehanizama endocitoze (klatrinske, kaveolarne, makropinocitoze) nismo spriječili ulazak MCMV u stanicu. Njegov transport kroz stanicu pratili smo inhibitorima vezikularnog transporta i ustanovili da jedino ukoliko je narušen integritet i aktinskih mikrofilamenat (citohalazin D) i mikrotubula (nokodazol) dolazi do inhibicije izražaja oba biljega virusne infekcije, što znači da je za prijenos virusnih proteina u staničnu jezgru potrebna točno određena citoarhitektura. Nadalje, inhibitor PKC i PKA (H-7) u potpunosti je inhibirao ozražaj E1, a djelomično i IE1 proteina tijekom rane faze infekcije (3-4 sata). Ispitujući pojedina svojstva ovog inhibitora široke specifičnosti, koristili smo dodatne specifične inhibitore pri čemu je inhibitor PKA (H-89) inhibirao izražavanje E1 virusnog proteina, inhibitori PKC (sangivamicin, kalfostin C) inhibirali izražaj oba proteina, čime smo potvrdili važnost uloge obje kinaze za ulazak ovih virusnih proteina u staničnu jezgru. Značaj uloge PKC potvrdili smo s PMA, aktivatorom PKC. Koristeći inhibitore progresije staničnog ciklusa, staurosporina i roskovitina, ustanovili smo ovisnost izražavanja ovih virusnih proteina o roskovitinu koji stanicu zaustavlja u određenoj kontrolnoj točki G1/S faze. Svi navedeni inhibitori nisu ostvarivali učinak tijekom kasne faze virusne infekcije (18-24 sata). Klasične MHC molekule I. razreda, nakon internalizacije inducirane virusom ulaze u neki od staničnih odjeljaka i degradiraju se, što pokazuju rezultati dobiveni s leupeptinom, inhibitorom lizosomske funkcije, pri čemu se degradacija odgađa na vremenski period duži od 24 sata p.i. Zaključak: Uspostavili smo model praćenja virusne infekcije, odnosno, ulaska virusnih proteina neposredne rane i rane faze virusnog replikacijskog ciklusa u staničnu jezgru. Ustanovili smo da MCMV ne ulazi u stanicu do sada poznatim mehanizmima endocitoze, a njegov prijenos kroz stanicu nije ovisan o kiselom pH endosomalnih odjeljaka. Ulazak virusnih proteina u staničnu jezgru ovisi o očuvanosti citoskeleta i aktivnosti PKC i PKA.

Mišji citomegalovirus; endocitoza; endosomi; vezikularni transport; inhibitori endocitoze; vezikularnog transporta i staničnog signaliranja; H-7; citoskelet; PKC; PKA; MHC molekule I. razreda

nije evidentirano