hrvatski

Aminopeptidaza(e) granula humanih neutrofilnih granulocita

Neutrofilni granulociti (NGR) su dio obrambenog sustava organizma, čije djelovanje ovisi o aktivnosti niza enzima, njihovoj lokalizaciji i svojstvima. U ovom radu su proučavane aminopeptidaze (AP) granula ovih stanica. Iz ljudskih NGR izdvojeno je šest subpopulacija granula i pokazano da sve osim želatinaznih (tercijarnih) granula sadrže AP s tim da je najveći dio njihove ukupne aktivnosti lociran u matriksu primarnih i sekundarnih granula. Analizom ovih granula utvrđeno je da aktivnost AP potječe od dva enzima. Razrađeni su postupci za njihovo pročišćavanje koji uključuju kromatografiju na DEAE-Sepharosi i hidroksilapatitu, gel filtraciju na Sephacrylu S-300 te FPLC na ionskim izmjenjivačima Mono Q i Mono S. Priređena je čista AP iz sekundarnih granula uz iskorištenje od 2.3 % i visoko pročišćena AP iz primarnih granula uz iskorištenje od 10.3 %. Karakterizacija enzima je pokazala da su oba oligomeri, s tim da je molekularna masa AP iz sekundarnih granula 305 kDa, a iz primarnih 185 kDa. Izoelektrična točka prvog enzima nalazi se oko pH 3.6, a drugog oko pH 8.6, dok su im optimalni pH djelovanja u području pH 7.0-7.5, odnosno pH od 6.0 do 6.2. Obje AP imaju široku specifičnost. Ona iz sekundarnih granula hidrolizira naftilamide L-aminokiselina s preferencijom Met > Ala > Leu > Lys, a AP iz primarnih granula s preferencijom Met > Phe > Trp, Leu > Lys. Peptidi su jednako dobri supstrati pročišćenih AP s tim da afinitet enzima raste od dipeptida prema pentapeptidu. Na afinitet utječe i aminokiselina na P1' položaju. Prva AP na ovom položaju preferira arginin, a druga fenilalanin. AP iz sekundarnih granula aktivirana je ionima kobalta i vrlo je osjetljiva na helirajuće agense. Inhibiraju je amastatin i probestin, a znatno manje puromicin. Na osnovu određenih svojstava enzim se može svrstati u metalopeptidaze. Najsličniji je membranskoj AP N (CD13). Metodom protočne citometrije pokazano je da je AP iz sekundarnih granula imunokemijski srodna AP N, što bi značilo da ove organele mogu biti pričuva za AP N koja se eksprimira na površini. AP iz primarnih granula aktivna je tek nakon redukcije tiolnim agensima, a inhibiraju je pHMB, E-64 i leupeptina što ju sve svrstava u tiolne peptidaze. Imunokemijska srodnost s tiolnom aminoendopeptidazom, katepsinom H nije nađena, pa se može smatrati da se radi o enzimu koji do sada nije bio opisan.

aminopeptidaza; izolacija; neutrofilni granulociti; primarne granule; sekundarne granule; želatinazne granule; sekretorne vezikule

nije evidentirano