hrvatski

Supresija amber mutacije u bakteriji Escherichia coli arhealnim ortolognim parom seril-tRNA-sintetaze i supresorske tRNA

Seril-tRNA-sintetaze (SerRS) pripadaju obitelji aminoacil-tRNA-sintetaza, enzima o kojima ovisi vjernost translacije zbog čega su neophodni za svaki organizam. Njihova specifična uloga sastoji se od prepoznavanja pripadajuće molekule tRNA i aminokiseline i njihovog povezivanja esterskom vezom. Bakterijske i eukariotske seril-tRNA-sintetaze imaju visoko očuvane slijedove, za razliku od onih iz metanogenih arheja koje duž slijeda imaju insercije i delecije u odnosu na konsenzusni slijed, pa čak i u motivu 2 aktivnog mjesta. In vitro, seril-tRNA-sintetaze iz metanogenih arheja pokazuju određenu fleksibilnost u prepoznavanju molekula tRNASer svih triju domena života, dok, s druge strane, SerRS iz E. coli jako diskriminira nepripadne tRNASer . Na temelju pokusa in vitro pokušali smo pokazati komplementaciju termosenzitivne SerRS iz E. coli (soj KL229) uvođenjem gena za SerRS iz M. jannaschii, M. kandleri i M. maripaludis. Komplementacija in vivo, međutim, nije opažena. Zanimljiva karakteristika pokusa bio je brži rast kolonija transformiranih praznim vektorom i onih na podlogama bez induktora, na permisivnoj temperaturi, od onih transformiranih vektorima s ugrađenim genima za SerRS iz metanogenih arheja induciranih arabinozom. Pošto arhealne SerRS nisu komplementirale SerRS iz E. coli, htjeli smo detektirati njihove interakcije s pripadajućim tRNA. Geni za amber-supresorske tRNA iz metanogenih arheja uneseni su u sojeve E. coli (JR104 ; XAC-A24) s amber mutacijama zajedno s genima za arhealne SerRS radi praćenja supresije. In vivo, supresija nije opažena, a ponovno su, pod olakšanim uvjetima rasta, brže rasle kolonije transformirane praznim vektorima. Ovakvi rezultati jaka su indikacija toksičnog efekta kojeg pokazuju arhealne SerRS eksprimirane u E. coli. Test aktivnosti b-galaktozidaze na transformiranom soju XAC-A24 pokazao je da razina supresije ne prelazi 10 %. Posumnjali smo da arhealne SerRS vežu serin na nepripadne tRNA u heterolognom okolišu. Indicija je bila pojačana činjenicom da duga varijabilna ruka, jak pozitivni identitetni element za tRNATyr, tRNASer i tRNALeu u E. coli, nedostaje kod arhealnih tRNATyr (69). Aminoaciliranje in vitro tRNATyr iz E. coli serinom pomoću SerRS iz M. maripaludis pokazalo se značajnim, indicirajući da arhealne SerRS u E. coli, osim pripadnih tRNA, seriliraju i endogenu tRNATyr, narušavajući vjernost translacije što rezultira sintezom nefunkcionalnih proteina.

metanogene arheje; seril-tRNA-sintetaze; supresija amber mutacije; supresorska tRNA; toksični efekt

nije evidentirano