hrvatski

Učinak mutacije sbcB15 na homolognu rekombinaciju tijekom transdukcije kod bakterije Escherichia coli - hiperrekombinacijski fenotip

Mutacije sbcB i sbcCD predstavljaju supresijske mutacije za recBC- fenotip i tada rekombinacijski procesi u stanici bakterije E.coli ovise o RecF-putu rekombinacije. Gen sbcB kodira za 3'-5' egzonukleazu na jednolančanoj DNA, a geni sbcC i sbcD kodiraju za podjedinice ATP-ovisne egzonukleaze na dvolančanoj DNA i ATP-neovisne endonukleaze na jednolančanoj DNA. Jedna varijanta mutacije sbcB, mutacija sbcB15, kodira za stabilan protein bez egzonukleazne aktivnosti koji vjerojatno zadržava sposobnost vezanja na 3'-krajeve jednolančane DNA. Cilj ovog rada bio je utvrditi prirodu hiperrekombinacijskog fenotipa koji se javlja prilikom transdukcijske rekombinacije u mutantima sbcB15. U tu sam svrhu konstruirala niz sojeva s različitim kombinacijama mutacija (uz mutaciju sbcB15) koje sam koristila za ispitivanje frekvencije transdukcijske rekombinacije, preživljenja nakon UV i gama-zračenja te za proučavanje stanične morfologije mikroskopskom analizom. Rezultati su pokazali da je rekombinacija u mutantima sbcB15 u cijelosti RecA-ovisna, te stoga po svom mehanizmu odgovara homolognoj rekombinaciji. Uz to, pokazalo se da hiperrekombinacijski fenotip u mutantima sbcB15 ovisi o funkciji proteina RecG i RuvABC. Mutacija sbcB15 povećala je učinkovitost transdukcijske rekombinacije kod pojedinačnih mutanata recBC i recF, ali nije imala nikakav učinak na rekombinaciju dvostrukih mutanata recBC recF. Na temelju ovih zapažanja zaključila sam da hiperrekombinacijski fenotip jednostrukih mutanata sbcB15 nastaje kombinacijom pojačane aktivnosti RecBCD- i RecF-ovisnih putova rekombinacije. Eksperiment s mutantom sbcB15 sbcD pokazao je da inaktivacija enzima SbcCD dodatno pojačava hiperrekombinacijski fenotip. Pretpostavila sam da mutirani protein SbcB15 svojim vezanjem na 3'-kraj štiti rekombinogenu jednolančanu DNA od razgradnje drugim nukleazama u stanici i na taj način povećava učinkovitost rekombinacije. Nukleaza SbcCD vjerojatno kompetira s proteinom SbcB15 pri vezanju na jednolančanu DNA i razgrađuje dio potencijalnih rekombinacijskih supstrata. Hiperrekombinacijski fenotip mutacije sbcB15 nije se pokazao tijekom rekombinacijskog popravka. Naime, sposobnost popravka jednolančanih praznina nakon UV-zračenja i dvolančanih lomova uzrokovanih gama-zračenjem nije se razlikovala između sbcB15, delsbcB mutanta i divljeg tipa. Izostanak hiperrekombinacijskog efekta tijekom popravka DNA vjerojatno odražava razlike između mehanizama reparatorne i transdukcijske rekombinacije. Mutacija sbcB15 nije sama po sebi utjecala na rast stanica, međutim dovela je do značajnog usporenja staničnog rasta kod mutanata recG ruvABC. Poznato je da mutanti recG ruvABC pokazuju poremećaje u segregaciji nukleoida i staničnoj diobi koji nastaju uslijed abortivnog rekombinacijskog popravka DNA, tj. nemogućnosti razrješenja Hollidayevih struktura. Mikroskopska analiza je pokazala da mutacija sbcB15 pogoršava poremećaje u segregaciji kromosoma i staničnoj diobi kod mutanata recG ruvABC. Pretpostavila sam da u odsutnosti funkcije proteina RecG i RuvABC, protein SbcB15 na neki način ometa razrješenje rekombinacijskih intermedijera. Prema tome, moguće je da u nekim tipovima rekombinacije protein SbcB15 utječe i na predsinaptičku i na postsinaptičku fazu rekombinacijskog procesa.

Escherichia coli; homologna rekombinacija; mutacija sbcB15; transdukcija

nije evidentirano