hrvatski

Obilježavanje proteina TROL s fluorescentnim proteinskim biljezima

Biljke su tijekom evolucije razvile različite mehanizme prilagodbe na promjene određenih uvjeta okoliša. Intenzitet osvjetljenja važan je ekološki čimbenik koji regulira fotosintetske procese u biljaka, ali točni regulacijski mehanizmi i komponente koje u njima sudjeluju još su uvijek prilično nepoznati. Sekvencioniranjem genoma biljke Arabidopsis thaliana i njegovom analizom, identificiran je gen At4g01050. Produkt ovog gena, protein TROL, posjeduje katalitički inaktivnu rodanaznu domenu i pretpostavljena je njegova lokacija u kloroplastima. To upućuje na potencijalnu regulatornu ulogu ovog proteina u procesu fotosinteze. Kako bi se točno potvrdila njegova unutarstanična lokacija i omogućilo daljnje istraživanje njegove funkcije, primjenjena je tehnika obilježavanja fluorescentnim proteinima. Ta tehnika omogućuje vizualizaciju i lokalizaciju željenog proteina, kao i praćenje njegove dinamike i interakcija sa drugim proteinskim komponentama stanice. U ovom je radu cDNA gena At4g0l050 ugrađena u plazmidni vektor pmAV4, koji posjeduje gen za žuti fluorescentni protein (YFP). cDNA gena At4g0l050 ugrađena je ispred YFP gena, tako da ekspresijom tog konstrukta u protoplastima, pod kontrolom CaMV 35S promotora i terminacijske regije gena za nopalin sintetazu (nos), nastane proteinska fuzija TROL-a i N-terminusa YFP-a. Ugradnja cDNA gena At4g0l050 u vektor pmAV4-YFP odvijala se kroz nekoliko koraka. Prvo je cDNA umnožena lančanom reakcijom polimeraze, upotrebom oligonukleotidnih početnica koje sadrže mjesta prepoznavanja za restrikcijske endonukleaze BamHI i SmaI. Tako su uvedena mjesta prepoznavanja tih enzima, koja originalno nisu prisutna u cDNA sekvenci gena At4g0l050. cDNA je tada ugrađena u EcoRV mjesto plazmidog T-vektora, prema principima TA kloniranja. Uspješna ugradnja potvrđena je metodom a-komplementacije i restrikcijskom analizom s enzimima BamHI i SmaI. cDNA je istim enzima izrezana iz T- vektora i ugrađena u vektor pmAV4-YFP, a uspješnost ove ugradnje također je potvrđena restrikcijskom analizom. Time je konstrukt bio završen i spreman za PEG-transfekciju. Naposlijetku su transformirani protoplasti biljnih vrsta A. thaliana i N. tabacum, a primjenom laserske konfokalne mikroskopije, fuzija TROL-a i žutog fluorescentnog proteina uspješno je lokalizirana u kloroplastima. Time je potvrđena pretpostavka o lokaciji proteina TROL u kloroplastima, a složeni konstrukt može poslužiti za daljnja istraživanja njegove potencijalne regulatome uloge, kroz interakcije s drugim proteinima.

rodanaze; Arabidopsis; fotosinteza

Za potpuni opis nedostaje podatak o datumu obrane diplomskog rada. (Admin.)