hrvatski

Molekularna epidemiologija CTX-M beta-laktamaza u Hrvatskoj

MOLEKULARNA EPIDEMIOLOGIJA CTX-M β -LAKTAMAZA U HRVATSKOJ DOSADAŠNJE SPOZNAJE I CILJ ISTRAŽIVANJA Β -laktamaze proširenog spektra (ESBL) obuhvaćaju tri velike porodice: TEM, SHV i CTX-M β -laktamaze i rijeđe vrste kao što su PER, VEB, GES i BES β -laktamaze . TEM i SHV β -laktamaze proširenog spektra su nastale od parentalnih TEM-1, TEM-2 i SHV-1 β -laktamaza mutacijama koje mijenjaju strukturu aktivnog središta tako da se širi spektar djelovanja enzima. Za razliku od njih CTX-M β -laktamaze su nativne ESBL a nastale su od kromosomskih β -laktamaza genusa Klyvera. Njihova glavna karakteristika je naglašena hidroliza cefotaksima i visok stupanj rezistencije na cefotaksim i ceftriakson. Nedavno su izolirani prvi sojevi Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae s visokim stupnjem rezistencije na cefotaksim u nekoliko bolnica diljem Hrvatske. MATERIJAL I METODE Istraživanje je provedeno na 15 izolata E. coli : pet iz KB Split, pet iz KBC Zagreb, dva iz KB „ Sestre Milosrdnice“ i tri iz Zavoda za javno zdravstvo grada Zagreb, te 6 izolata K. pneumoniae iz KB „ Sestre Milosrdnice“ . Izolati su prikupljeni iz različitih bolesničkih materijala i različitih odjela i identificirani su konvencionalnim biokemijskim testovima. Osjetljivost na amoksicilin sam i u kombinaciji s klavulanskom kiselinom, piperacilin sam i kombiniran s tazobaktamom, cefuroksim, ceftazidim sam i u kombinaciji s klavulanatom, cefotaksim sam i kombiniran s klavulanskom, ceftriakson, ceftibuten, cefepim, cefoksitin, imipenem, meropenem, gentamicin i ciprofloksacin je određivana bujonskom mikrodilucijskom metodom po CLSI. Detekcija β -laktamaza proširenog spektra je dvostrukim disk sinergističkim testom a produkcija ESBL je potvrđena na temelju redukcije MIK-a cefotaksima u prisustvu klavulanske kiseline (4 mg/L) za najmanje tri razrijeđenja. Prijenos rezistencije na cefotaksim je vršen metodom transkonjugacije uz uporabu E. coli A15R- soja rezistentnog na rifampicin kao recipijenta. Β -laktamaze proširenog spektra su karakterizirane izoelektričnim fokusiranjem, određivanjem supstratnog profila, lančanom polimeraznom reakcijom (PCR) s početnicima specifičnim za TEM , SHV i CTX-M β -laktamaze i sekvenciranjem blaCTX-M gena. PCR je također korišten za istraživanje genetskog okruženja blaESBL gena. Genetska srodnost izolata je određivana elektroforezom u pulsirajućem polju. REZULTATI Unatoč određenim razlikama, testiranje osjetljivosti na antibiotike je pokazalo značajne različitosti između grupa izolata prikupljenih u tri bolnice. Izolati iz KBC Zagreb su bili uniformni u fenotipu i stupnju rezistencije i općenito su bili otporniji na antibiotike od ostalih sojeva iz drugih ustanova. Za razliku od ostalih izolata oni su pokazivali povišeni MIK ceftazidima (8-32 mg/L) i bili su visoko rezistentni na aminoglikozide i ciprofloksacin. Ostali izolati su bili osjetljivi na cefazidim i iskazivali različiti fenotip rezistencije na ostale ne β -laktamske antibiotike. Šest izolata K. pneumoniae je pokazivalo rezistenciju na ciprofloksacin, a pet od njih i na aminoglikozide. Osjetljivost na ceftazidim je bila varijabilna (MIK ceftazidima 8-64). Osam izolata je prenijelo rezistenciju na cefotaksim na recipijent. U toj skupini je pet izolata E. coli iz KBC Rebro koji su prenijeli rezistenciju uz frekvenciju od 10-5. Rezistencija na aminoglikozide, tetraciklin i kotrimoksazol je prenesena zajedno s rezistencijom na cefotaksim. Tri izolata E. coli iz Splita su prenijeli rezistenciju na cefotaksim uz frekvenciju od 10-6 do 10-7 i uz različite markere rezistencije. Tri izvanbolnička izolata nisu prenijela rezistenciju na recipijent. Konjugacije je uspjela uz nisku frekvenciju u pet izolata K. pneumoniae uz istovremeni prijenos rezistencije na tetraciklin. Svi izolati su proizvodili β -laktamazu s visokom izoelektričnom točkom (pI), 8.9 u slučaju izolata iz KBC Zagreb ili 8.4 u preostalih izolata. PCR za blaCTX-M je bio pozitivan, a sekvenciranje blaCTX-M gena je otkrilo CTX-M-15 β -laktamazu u izolata s pI 8.9 i CTX-M-3 u izolata s pI 8.4. Insercijska sekvenca ISFcp1 je identificirana 48 pb uzvodno u svih blaCTX-M-15 producenata i 128 pb uzvodno od jednog blaCTX-M-3 gena, dok su ostali blaCTX-M geni imali pridružen IS26 element. Dva izolata K. pneumoniae su bila podvrgnuta sekvenciranju blaCTX-M gena koje je identificiralo CTX-M-3 β -laktamazu. Izvanbolnički izolati su posjedovali CTX-M-14 β -laktamazu. Pet E. coli producentata CTX-M-15 β -laktamaze iz KBC Zagreb su imali identične PFGE profile, ali različite od svih ostalih izolata. Grupa E. coli CTX-M-3 producenata iz Splita je imala raznolike PFGE profile, a samo dva izolata su bila klonski srodna. ZAKLJUČAK Istraživanje je pokazalo da u Hrvatskoj dominiraju dva tipa CTX-M β -laktamaza među enterobakterijama u bolničkom ambijentu: CTX-M-3 i CTX-M-15. U izvanbolničkoj populaciji dominira CTX-M-14 β -laktamaza. Usprkos sličnosti enzima, razlike u genetskom kontekstu blaCTX-M gena pokazuju da su se dva tipa enzima pojavila neovisno jedan o drugom. Također je moguće da postoje dva različita podrijetla CTX-M-3 β -laktamaze što je zanimljivo s obzirom na malu geografsku regiju iz koje potječu izolati. CTX-M-15 β -laktamaza se proširila klonalno u KBC Zagreb, dok se u Splitu širenje CTX-M-3 β -laktamaze vjerojatno dogodilo horizontalnim širenjem blaCTX-M-3 gena među nesrodnim sojevima. CTX-M- β -laktamaze su još uvijek relativno rijetke u Hrvatskoj za razliku od nekih drugih zemalja gdje su postale dominantni tip ESBL kao što je slučaj u Švicarskoj ili južnoj Americi. CTX-M-3 β -laktamaza je dominantan tip u istočnoj Europi, dok je CTX-M-15 proširena po čitavom svijetu.

CTX-M beta-laktamaze; cefotaksim; Escherichia coli

nije evidentirano