hrvatski

Transfekcija fibroblasta hrčka u kulturi genom za ljudsku sulfotransferazu

Prethodna istraživanja pokazala su da enzim sulfotransferaza (ST) katalizira prijenos sulfatne skupine s kofaktora 3'-fosfoadenozil-5'-fosfosulfata (PAPS) na različite nukleofilne akceptore kao što su hidroksilne, sulhidrilne i amino skupine. Svi dosada dobro poznati enzimi vertebrata, kao kofaktor upotrebljavaju prethodno navedeni PAPS, koji se može regenerirati u dva stupnja enzimatskih reakcija uz neophodnu prisutnost anorganskog sulfata i adenozin-5' trifosfata (ATP). Enzim ST se u organizmu pojavljuje u dva oblika ; u Golgi-jevom aparatu kao membranski vezani protein i citosolni enzim. S obzirom da su prethodna istraživanja dokazala razmerno malu supstratnu specifičnost citosolnih enzima, važnost istraživanja ovih enzima je utoliko veća. Katalitičko djelovanje ovih enzima je da metaboliziraju različite kemijske spojeve čiji produkti mogu biti citotoksični i genotoksični, te na taj način mogu povećati karcinogeni rizik izloženog organizma. Da bismo mogli dokazati spomenuti učinak ST bila je potrebna prethodna ugradnja gena hSULT 1A2 u stanice V79mz i izolacija eksprimiranog enzima. Upotrebom CaCl2 metode, omogućili smo transfekciju stanične kulture fibroblasta hrčka V79mz genom za ljudsku sulfotransferazu (hSULT 1A2). Količinu eksprimiranog enzima dokazali smo metodeom za sprektofotometrijsko određivanje proteina po Lowry-u, a njegovu katalitičku djelotvornost odredili smo metodom za određivanje aktivnosti enzima sulfotransferaze. Da bismo potvrdili rezultate dobivene prethodno navedenim metodama upotrijebili smo i Western-Blot tehniku u kojoj smo dokazali, putem imunološke reakcije, prisutnost eksprimiranog enzima hSULT 1A2 u citosolu. Na fotografskom filmu utvrdili smo vrpce koje pokazuju mjesta specifične imunološke reakcije između antitijela anti - rEST i hSULT 1A2. Naši rezultati su pokazali da je u 39% od ukupno izoliranih staničnih klonova došlo do ekspresije prethodno ugrađenog gena hSULT 1A2 u genom stanica V79mz. Osim što se enzim hSULT 1A2 u pojedinim klonovima eksprimirao u velikoj količini, on je i katalitički bio vrlo aktivan, međutim njegova aktivnost nije bila proporcionalna količini njegove ekspresije, što je vrlo bitno, ako se želi primjeniti u svrhu daljnjih toksikoloških istraživanja.

transfekcija; fibroblasti hrčka; ljudska sulfotransferaza

nije evidentirano