hrvatski

Promjene stanične imunosti u bolesnika s teškom ozljedom mozga

Infekcije su vodeći uzrok pobola i smrtnosti bolesnika s teškom ozljedom mozga. Do danas još uvijek nije u potpunosti razjašnjen mehanizam odgovoran za povećanu sklonost infekcijama u ovih bolesnika. Cilj ovog istraživanja je bio utvrditi najčešće infekcije i njihove uzročnike u bolesnika s teškom ozljedom mozga, ispitati promjene stanične imunosti, poglavito udjela leukocitnih subpopulacija, izražavanje citotoksičnog posrednika perforina, aktivnost stanica NK i izražaj pojedinih citokina u različitim imunokompetentnim stanicama periferne krvi bolesnika s teškom ozljedom mozga u ranom razdoblju nakon ozljede. U istraživanje je bilo uključeno 40 bolesnika s teškom ozljedom mozga u dobi od 18. do 75. godine života. Zdravi i dobrovoljni davaoci krvi su bili kontrolna skupina. Demografski, klinički i laboratorijski podatci sakupljani su i analizirani su za svakog bolesnika. Svakom bolesniku s teškom ozljedom mozga 1., 4., 7. i 10. dana nakon ozljede uzimali smo uzorak trahealnog aspirata, krvi i mokraće te slali na mikrobiološku analizu. Prvog, 4. i 7. dana nakon ozljede svakom bolesniku uzimali smo 20 ml heparinizirane venske krvi za imunološka istraživanja. Mononuklearne stanice periferne krvi izdvojili smo centrifugiranjem na gradijentu gustoće, te višestrukim obilježavanjem površinskih biljega metodom izravne imunofluorescencije analizirali njihov fenotip i stupanj aktivacije protočnom citometrijom. Izdvojene mononuklearne stanice obilježavali smo istovremeno protutijelima na površinske biljege kako bi utvrdili njihovu pripadnost pojedinim leukocitnim populacijama, permeabilizirali njihovu membranu te metodom izravne i neizravne imunofluorescencije unutarstanično obilježavali perforin, interleukin (IL)-4, IL-15, IFNγ (interferon gama), TNFα (engl. tumor necrosis factor alpha, čimbenik tumorske nekroze alfa) korištenjem odgovarajućih monoklonskih protutijela, te smo stanice analizirali na protočnom citometru. Uzorci koji su bili predviđeni za unutarstanično obilježavanje citokina prethodno smo stimulirali s PMA (engl. phorbol myristate acetat), ionomicinom i monenzinom radi prikazivanja citokina u stanici. Imunocitokemiju smo koristili za prikazivanje molekule perforina i citokina IL-15 u preparatima svježe izdvojenih mononuklearnih stanica periferne krvi. Metodom pozitivne i negativne magnetske separacije iz mononuklearnih stanica periferne krvi izdvojili smo stanice NK i određivali njihovu citotoksičnu aktivnost prema K-562 NK osjetljivoj staničnoj liniji korištenjem PKH-26 (red) dvosatnog testa citotoksičnosti uz očitavanje protočnim citometrom. U 55% bolesnika s teškom ozljedom mozga došlo je do razvoja infekcije (pneumonije, sepse i infekcije mokraćnih putova) s najvećom učestalosti pojave 4. dana nakon ozljede. Najčešći uzročnici pneumonije bili su Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa i Escherichia colli. Sepsa je bila najčešće uzrokovana bakterijom Straphylococcus aureus, dok su najčešći uzročnici infekcije mokraćnih putova bili bakterije Enterococcus faecalis i Escherichia colli, te gljivca Candida albicans. Četvtog dana nakon ozljede u perifernoj krvi bolesnika s teškom ozljedom mozga zabilježili smo statistički značajano smanjenje postotka limfocita T, osobito CD3+CD8+CD56- subpopulacije, smanjenje udjela stanica NK-T, stanica NK i njihovih CD3-CD56+dim i CD3-CD56+bright subpopulacija. Postotak limfocita B nije se značajno mijenjao u perifernoj krvi bolesnika s teškom ozljedom mozga, dok je udio monocita značajno porastao 1. dana nakon ozljede u odnosu na kontrolnu skupinu i smanjio se 7. dana. Inficirani bolesnici s teškom ozljedom mozga imali su statistički značajno smanjenje udjela limfocita T i stanica NK 4. dana nakon ozljede u odnosu na 1. dan i kontrolnu skupinu. U bolesnika s teškom ozljedom mozga zabilježili smo vrlo niski udio proupalnih citokina (IFNγ, TNFα, IL-15) i prevlast IL-4 nad IFNγ u svim leukocitnim subpopulacijama. Stimulacija monocita periferne krvi bolesnika s teškom ozljedom mozga s različitim koncentracijama lipopolisaharida (LPS) potiče stvaranje IFNγ 1. i 7. dana nakon ozljede kao i u kontrolnoj skupini, ali nema učinka 4. dana nakon ozljede. Statistički značajno smanjenje postotka perforin pozitivnih limfocita, uključujući limfocite T, stanice NK i stanice NK-T, zabilježeno je u perifernoj krvi bolesnika s teškom ozljedom mozga 4. dana nakon ozljede. Sedmog dana nakon ozljede povećao se udio perforin pozitivnih limfocita s citotoksičnim fenotipom (CD3+CD8+CD56- limfociti T, stanice NK i stanice NK-T) u odnosu na 1. dan. Izdvojene stanice NK iz periferne krvi bolesnika s teškom ozljedom mozga imaju statistički značajno manju citotoksičnost prema NK osjetljivoj staničnoj liniji K-562 4. i 7. dana nakon ozljede u odnosu na 1. dan i kontrolnu skupinu. Četvrtog dana nakon ozljede u bolesnika s teškom ozljedom mozga nađena je pozitivna korelacija između GCS, kao pokazatelja težine ozljede mozga, te postotka limfocita T i stanica NK, kao i između GCS i postotka perforin pozitivnih stanica, uključujući CD3+ perforin+ i CD56+ perforin+ stanice. Visoka učestalost infekcija u bolesnika s teškom ozljedom mozga u ranom razdoblju nakon ozljede mogla bi se objasniti smanjenjem postotka stanica s citotoksičnim fenotipom, smanjenim udjelom perforina u limfocitnih subpopulacijama i njihove citotoksične aktivnosti, te stvaranja proupalnih citokina.

perforin; pneumonije uzrokovane strojnom ventilacijom; stanice NK; stanice NKT; stanična imunost; teška ozljeda mozga

nije evidentirano