hrvatski

Izolacija virusa na staničnoj kulturi

Sastav stanične kulture. Stanična kultura se sastoji od krute ( stanice humanog ili životinjskog podrijetla) i tekuće ( npr. MEM -minimalni esencijalni medijum: puferski sistem, vitamini, aminokiseline, šećeri i dr., životinjskog seruma, male količine antibiotika i indikatora za pokazivanje pH sredine) faze. Dobivanje pojedinačnih stanica. Proteolitički enzimi selektivno razgrađuju proteinski matriks koji veže stanice u kulturi, te tako omogučuju dispergiranje stanica prije no što i same budu oštećene tim enzimima. U tu svrhu najčešće se upotrebljava tripsin tj. otopina tripsin - versena. Primarnom kulturom smatramo onu koju smo po prvi puta priredili i koju možemo održavati kroz još nekoliko tripsinizacija ( pasaža). Ukoliko takva stanična kultura može podnjeti preko 70-tak pasaža smatramo ju staničnom linijom ili kontinuiranom kulturom ( Tablica 1.). Tablica 1. Kontinuirane stanične kulture ( prema ATCC - American Type Culture Collection) Ime stan. kultureGodina proizvodnjePodrijetloMorfologijaVirusna prijemljivost HeLa1952humane, karcinom cerviksa uterusaepiteloidnepoliovirusi, adenovirusi, i dr. Hep-21952humane, karcinom larinksaepiteloidnepoliovirusi, adenovirusi, i dr. KB1955humane, karcinom usne šupljineepiteloidnepoliovirusi, adenovirusi, i dr. FL1957humane normalne,koštana sržepiteloidnepoliovirus Detroit-981956humane normalne, koštana sržepiteloidnepoliovirusi, adenovirusi, i dr. Wi - 261962humane, pluća embrionafibroblastiveliki broj humano-patogenih virusa Wi - 381961humane, diploidne, pluća embrionafibroblastiveliki broj humano-patogenih virusa Vero1963afrički zeleni majmun, bubregfibroblastipoliovirusi, adenovirusi, i mnogi dr. BSC-11963afrički zeleni majmun, bubregepiteloidnepoliovirusi i dr. BHK-211962hrčak, bubregfibroblastiadenovirusi, poxvirusi MDCK1958pas Cocker spaniel, bubregepiteloidneCoxackie virusi, reovirusi, adenovirusi, Neke stanične kulture mogu podnjeti i 500-tinjak pasaža ( HeLa, GMK- green monkey kidney- bubreg zelenog majmuna). Zato su pogodne za upotrebu u rutinskoj virološkoj dijagnostici kao jednostavni medij za izolaciju virusa. Stanice u kontinuiranoj kulturi gube diploidni broj kromosoma, te postaju heteroploidne. Neke kulture mogu zadržati diploidni broj kromosoma i do 50-te pasaže ( humane diploidne stanice npr. Wi - 38 ). Zato se takve humane dipliodne stanične kulture rabe za prizvodnju virusnih cjepiva. Umnažajući se u staničnoj kulturi virusi stvaraju tzv. citopatični efekt (CPE) tj dovode do tipične degeneracije inficiranih stanica koja se može vidjeti svjetlosnim mikroskopom bilo u nativnoj bilo u obojanoj ( hemalaunom i eozinom) staničnoj kulturi. Titracija izoliranog virusa - TCID50 ( Tissue Culture Infective Doses - 50% infektivna doza za staničnu kulturu). Količina infektivnog virusa prisutnog u staničnoj kulturi ( tekuća faza) može se titrirati određujući najveće razrjeđenje tekuće faze koje još izaziva CPE u 50% inokuliranih staničnih kultura. Test se radi u epruvetama i očitava nativno u svjetlosnom mikroskopu. Izračunavanje titra TCID50 po Reed-Muenchovoj metodi. Tablica 2. Podaci o CPE virusa na staničnoj kulturi razrjeđenje virusa omjer CPECPE pozitivanCPE negativan 10-18/880 10-28/880 10-37/871 10-42/826 10-50/80 8 Strelice označavaju smjer zbrajanja akumuliranih vrijednosti Tablica 3. Akumulirane vrijednosti iz podataka o CPE razrjeđenje virusaCPE pozitivanCPE negativanrazvoj CPE omjerpostotak 10-125025/25100 10-217017/17100 10-3-919/10 90 10-4272/9 22 10-5-0150/15 0 Proporcionalna distancija između dva razrjeđenja je u navedenom primjeru ( Tablica 2 i 3) između 10-3 i 10-4 tj. tu se nalazi krajnji 50% titar virusa. Izračunava se na slijedeći način: % CPE iznad 50 - 50% 90 - 50 40 0.6 % CPE iznad 50% - % CPE ispod 50% 90 - 22 68 Negativni logaritam TCID50 titra = negativni log. razrjeđenja iznad 50% CPE + proporcionalna distancija, tj. negativni log. TCID50 titra = 3.0 + 0.6 = 3.6, tj. TCID50 titar = 10-3.6 po 0.1 ml suspenzije ( tekuće faze stanične kulture). Tipizacija izoliranog virusa na staničnoj kulturi - to je postupak neutralizacije virusa specifičnim protuvirusnim protutijelima. Napravi se mješavina izoliranog virusa koja izaziva 100 TCID50 ( npr. za gore navedeni titrirani virus 100 TCID50 je -3.6 + 2.0 = -1.6 ) i poznatog dijagnostičkog seruma ili monoklonskih protutijela u jednakim volumenima, te se inkubira 1 sat na 37 0C . Potom se 0.2 ml dobivene mješavine inokulira u po nekoliko epruveta s staničnom kulturom i kroz nekoliko slijedećih dana promatra razvoj CPE. / Kontrola test doze virusa, te kontrola pozitivnog i negativnog seruma radi se paralelno s glavnim testom./ Ukoliko se CPE ne javi, dokaz je to homologne reakcije između virusa i protutijela, te je time virus tipiziran. Osim CPE, virusi stvaraju i uklopine u citoplazmi ili jezgri stanice domačina tj na mjestu gdje se umnažaju. Virusne uklopine su nakupine od više tisuća virusnih čestica ili virusnih proteina, a vide se svjetlosnim mikroskopom u obojenim staničnim kulturama. Ako se virus umnaža u staničnoj kulturi ali ne stvara vidljivi CPE, može se dokazati imunofluorescentnim metodama ( DFA ili IFA ) istim postupkom kao u prikazu 2.u 1.vježbi iz virologije. Tako npr. dokazujemo virus influence tip A i B umnožen u MDCK linijskoj kulturi. Za neke viruse možemo upotrijebiti i metodu hemadsorpcije (HAD) da bi ih dokazali u stanici ( npr. mumps virus, parainfluenca viruse i morbili virus), vidi 4. vježbu iz virologije. Fenomen HAD promatramo u svjetlosnom mikroskopu u nativnoj staničnoj kulturi.

izolacija virusa, stanična kultura, citopatski efekt (CPE)

nije evidentirano