hrvatski

Utvrđivanje virusa na autohtonim sortama vinove loze (Vitis vinifera L.) u Dalmaciji serološkim, molekularnim i biološkim metodama

Istraživanje zaraženosti virusima 14 autohtonih sorata vinove loze koje se uzgajaju na području Dalmacije provedeno je u 51. vinogradu na biljkama uključenima u masovnu pozitivnu klonsku selekciju. Sorte obuhvaćene istraživanjem bile su: Babica, Babić, Dobričić, Glavinuša, Grk, Ljutun, Maraština, Mladenka, Ninčuša, Plavac mali, Plavina, Pošip, Vlaška i Vugava. Područja obuhvaćena istraživanjem bila su otok Vis, Svetac, Hvar i Korčula, poluotok Pelješac, područje Kaštela i Primoštena te okolica Šibenika i Čitluka. Od simptoma virusnih infekcija najčešće su zabilježeni oni karakteristični za viruse iz kompleksa uvijenosti lista vinove loze u vidu prijevremene promjene boje i uvijanja ruba lisne plojke prema naličju. Sporadično su zabilježene promjene karakteristične za infektivnu degeneraciju u obliku nepravilnog grananja, skraćenih internodija, dvostrukih nodija te neujednačenog dozrijevanja bobica unutar grozdova. Ukupno 1116 biljaka testirano je metodom ELISA na prisutnost 9 virusa: Arabis mosaic virus (ArMV), Grapevine fanleaf virus (GFLV), Grapevine fleck virus (GFkV), Grapevine leafroll-associated virus 1 (GLRaV-1), Grapevine leafroll-associated virus 2 (GLRaV-2), Grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3), Grapevine leafroll-associated virus 7 (GLRaV-7), Grapevine virus A (GVA) i Grapevine virus B (GVB). Provedenim testovima utvrđena je prisutnost 8 virusa: GLRaV-3 u 888 (79, 57%) uzoraka, GVA u 685 (61, 38%), GLRaV-1 u 455 (40, 77%), GFkV u 223 (19, 98%), GFLV u 219 (19, 62%), GLRaV-2 u 46 (4, 12%), ArMV u 36 (3, 23%) te GVB u 35 (3, 14%) uzoraka. Iako su rezultati metode ELISA primjenom kompleta proizvođača Agritest kod 18 uzoraka upućivali na prisutnost GLRaV-7, kod navedenih uzoraka dobiveni su negativni rezultati korištenjem ELISA-kompleta tvrtke Sediag te metodom RT-PCR uz korištenje dva različita para početnica. Ukupno 93 biljke (8, 33%) bile su slobodne od svih testiranih virusa, 168 (15, 05%) uzoraka bilo je zaraženo samo s jednim virusom, 368 (32, 98%) s dva, 314 (28, 14%) s tri, 127 (11, 38%) s četiri, 43 (3, 85%) s pet, dok je istovremena zaraza s 6 virusa utvrđena kod 3 (0, 27%) uzorka. Prisutnost GLRaV-2 u 16 ELISA-pozitivnih uzoraka uspješno je potvrđena primjenom metode RT-PCR uz korištenje GLR2CP1/GLR2CP2 para početnica. Ukupno 4 RT-PCR produkta dobivena iz različitih uzorka vinove loze direktno su obostrano sekvencirana te je analizom gena za kapsidni protein utvrđena podudarnost nukleotidnih sljedova između 97, 9 i 99, 6% uz potpunu podudarnost na aminokiselinskom nivou. U usporedbi s izolatom 93/955 podudarnost na nukleotidnom nivou iznosila je između 91, 8 i 92, 1%, a na aminokiselinskom nivou 96, 2% za sve hrvatske izolate. Mehanički prijenos s 16 uzoraka vinove loze na vrstu Nicotiana benthamiana L. nije bio uspješan. Kod 14 ELISA-pozitivnih uzoraka na GVB navedeni virus dokazan je i metodom RT-PCR korištenjem para početnica H28/C410. Devet RT-PCR produkata dobivenih iz različitih uzoraka vinove loze uspješno je obostrano sekvencirano. Analizom dijela četvrtog otvorenog okvira čitanja (ORF4), intergenske regije te dijela ORF5 utvrđena je podudarnost hrvatskih izolata između 81, 3 i 99, 5% na nukleotidnom nivou, a u usporedbi s GVB referentnim izolatom NC_003602 između 79, 8 i 83, 9%. Usporedbom aminokiselinskih sljedova ORF5 hrvatskih izolata utvrđena je podudarnost između 81, 4 i 100%, a u odnosu na referentni izolat između 83, 2 i 86, 7%. Mehaničkom inokulacijom indikatorskih vrsta Nicotiana cavicola N. T. Burb. i Nicotiana occidentalis Wheeler virus je uspješno prenesen s 11 od 14 biljaka vinove loze. Primarni simptomi na zeljastim biljkama očitovali su se kao poligonalne klorotične pjege i prosvjetljavanja lisne nervature, dok su sekundarni simptomi, ovisno o izvoru inokuluma, bili izraženi u obliku nekrotičnih lokalnih lezija, žućenja, uvijanja rubova listova prema licu ili naličju, deformacija i mjehuravosti listova te rozetastog rasta. Prema našim saznanjima provedeno istraživanje predstavlja prvi nalaz GLRaV-2 i GVB u Hrvatskoj.

virusne bolesti vinove loze; autohtone sorte vinove loze; ELISA; RT-PCR; biotestovi; sekvenciranje

nije evidentirano