hrvatski

Dokazivanje herpes simplex virusa metodom lančane reakcije polineraze u epidrmalnim i genitalnim brisevima i cerebrospinalnom likvoru pacijenata

Ispitana je učinkovitost lančane reakcije polimeraze (PCR) i neradioaktivnog obilježavanja DNA hibrida u detekciji Herpes simpleks virusa (HSV) iz 34 klinička uzorka. HSV je u uzorcima detektiran standardnim virološkim tehnikama (DTFA metodom, izolacijom na staničnim kulturama i DTFA tipizacijom). Nakon što je iz staničnih kultura (HeLa i GMK) inficiranih sa HSV-1 i HSV-2 virusom, uz pomoć fenola i kloroforma izolirana DNA, specifični DNA fragment umnožen je PCR metodom pri čemu su korištene specifične oligonukleotidne početnice. Amplifikacijski produkti elektroforetski su razdvojeni na 2%-tnom agaroznom gelu i ukoliko su bili prisutni, obilježena je specifična HSV DNA proba. DNA proba je obilježena nasumičnim ubacivanjem digoksigeninom obilježenog deoksiuridin trifosfata (DIG-dUTP). Napravljeni su Southern transfer i dot- blot na pozitivno nabijenu najlonsku membranu (Boehringer Mannheim Nylon Membran). Nakon hibridizacije digoksigeninom obilježene DNA probe i ciljane DNA, hibridi su detektirani imunološko-enzimatskom metodom koja koristi konjugat protutijela i odgovarajuću enzimom kataliziranu reakciju bojenja. HSV DNA je uspješno umnožena i detektirana u supernatantu staničnih kultura inficiranih sa HSV, a nije detektirana u supernatantu kliničkih uzoraka, što se može objasniti širenjem virusa iz stanice u stanicu i činjenicom da ne dolazi do nakupljanja virusa u međustaničnim prostorima. HSV DNA detektirana je i direktno u dva klinička uzorka. U usporedbi sa standardnim virološkim metodama osjetljivost PCR reakcije bila je 92%, a specifičnost 100%.

herpes simpleks virus (HSV); lančana reakcija polimeraze/ polymerasa chain reaction- PCR/; obiježavanje DNA digoksigeninom (DIG)

nije evidentirano