hrvatski

Određivanje metalotioneina diferencijalnom pulsnom voltametrijom - primjena u biomonitoring studijama

Određivanje metalotioneina diferencijalnom pulsnom voltametrijom - primjena u biomonitoring studijama Vlatka Filipović Marijić, Zrinka Dragun, Marijana Erk, Biserka Raspor Zavod za istraživanje mora i okoliša, Institut "Ruđer Bošković", Bijenička 54, 10000 Zagreb vfilip@irb.hr Metali unešeni u vodne ekosustave, prirodnim ili antropogenim izvorima, predstavljaju važna potencijalna zagađivala u okolišu. U svrhu što ranijeg otkrivanja izloženosti organizama metalima prate se promjene na staničnoj razini organizma putem biomarkera. Pobudna sinteza metalotioneina (MT), niskomolekulskih citosolskih proteina odgovornih za održavanje homeostaze esencijalnih (Zn, Cu) i detoksikaciju toksičnih metala (Cd, Hg, Ag) predstavlja biomarker izloženosti metalima. Kao organizmi na vrhu hranidbenog lanca u vodnim ekosustavima, te važan dio prehrane čovjeka, ribe predstavljaju često korištene i važne indikatorske organizme u biomonitoring studijama.1, 2 Ovo istraživanje obuhvaća praćenje razina MT u škrgama (unos metala) i jetri (akumulacija metala) klenova (Squalius cephalus L.) na 5 postaja rijeke Sutle (Hum na Sutli, Donje Brezno, Kumrovec, Klanjec, Drenje Brdovečko), u svrhu procjene opterećenja riječnog ekosustava metalima. Koncentracija MT u tkivima klenova određena je diferencijalnom pulsnom voltametrijom, metodom po Brdički, kojom se određuju proteini koji sadrže tiolne skupine u amonijačnoj otopini kobaltove(III) soli (1M NH4Cl + 1M NH4OH, pH=9, 5 i 6x10-4 M Co(NH3)6Cl3).3 Mjerenje je provedeno na 797 Computrace (Metrohm) uređaju s troelektrodnim sustavom (radna elektroda (viseća živina kap), protuelektroda (platinska žica) i referentna elektroda (Ag/AgCl/3M KCl)) u ćeliji termostatiranoj na 20°C, pri sljedećim mjernim parametrima: početni/završni potencijal: -0, 9/-1, 65V ; amplituda/trajanje naponskog pulsa: 0, 02502V/0, 057s ; vrijeme ponavljanja pulsa: 0, 5s ; brzina promjene potencijala: 0, 005Vs-1. Prije mjerenja je iz otopine uklonjen kisik propuštanjem dušika visoke čistoće. Na temelju toplinske stabilnosti, MT se određuju u toplinski obrađenom citosolu koji je odvojen iz tkiva jetre i škrga klenova nakon centrifugiranja na 50000xg i toplinske obrade na 85°C. Brdičkina metoda se temelji na određivanju visine katalitičkog vala vodika pri potencijalu Ep = -1, 48 V, koji je proporcionalan koncentraciji proteina koji sadrže tiolne skupine, uključujući MT. Kao kalibrant je korišten MT zečje jetre (MT-95-P, Ikzus Proteomics) otopljen u 0, 25 M NaCl. Srednja vrijednost koncentracije MT iznosi 1, 48±0, 57 mg g-1 mokre mase jetre, odnosno 1, 55±0, 28 mg g-1 mokre mase škrga klena. Usporedba koncentracija MT u jetri i škrgama klenova na 5 odabranih postaja ukazuje na značajno povišene razine MT na gornjem dijelu toka rijeke Sutle (Hum na Sutli i Donje Brezno). Analize ukupnih koncentracija otopljenih metala u rijeci Sutli (povišene koncentracije prioritetnih opasnih metala (Pb, Ni, Cd), kao i metala s visokim afinitetom vezanja na MT (Cd i Cu)), fizikalno-kemijskih pokazatelja, te mikrobiološko-parazitološke analize ukazuju na nepovoljne uvjete života na tom istom dijelu vodotoka.4 Zaključujemo da je metoda određivanja MT po Brdički dovoljno osjetljiva da omogući praćenje promjena MT između pojedinih lokaliteta, kao pokazatelja povećanog stresa za vodne organizme uslijed opterećenja vodnih ekosustava zagađivalima, a napose metalima. Literatura: 1. V. Filipović Marijić i B. Raspor, Toxicol. Lett. 168 (2007) 292-301. 2. V. Filipović Marijić i B. Raspor, Comp. Biochem. Phys. C 152 (2010) 133-138. 3. B. Raspor, M. Paić i M. Erk, Talanta 55 (2001) 109-115. 4. Z. Dragun, D. Kapetanović, B. Raspor i E. Teskeredžić, Ambio 40 (2011) 391-407.

Brdičkina reakcija; klen; metali; Sutla

nije evidentirano