hrvatski

Primjena diferencijalne pulsne voltametrije u procjeni izloženosti vodnih ekosustava metalima

Metali imaju posebnu važnost među onečišćujućim tvarima jer nisu biorazgradivi, već se raspodjeljuju između vode, sedimenta i biote. Procjenu utjecaja metala na biološku komponentu omogućava praćenje promjena (biomarkeri) u indikatorskih organizama, u vodnih ekosustava najčešće školjkaša, rakova i riba. Organizmi unose esencijalne metale kao neophodne mikronutrijente, a zbog kemijske sličnosti uz njih se unose i toksični metali, koji nemaju biološku ulogu u organizmu te mogu štetno djelovati na različitim organizacijskim nivoima, od stanice do populacije. Procjenu toksičnih učinaka metala već na staničnoj razini organizma omogućavaju citosolski proteini metalotioneini (MT), koji sudjeluju u održavanju homeostaze esencijalnih (Zn, Cu) i detoksifikaciji toksičnih metala (Cd, Hg, Ag). Sustavno praćenje (biomonitoring) metalotioneina temelji se na njihovoj indukciji pri povišenim razinama metala, koja se najčešće prati u metabolički aktivnim tkivima, jetri, bubrezima i škrgama.1 Zadnjih nekoliko desetljeća uočena je učinkovita akumulacija metala, osobito toksičnih, u crijevnih nametnika riba iz razreda kukaša (Acanthocephala). Zbog toga su se počela provoditi istraživanja o mogućoj primjeni kukaša kao bioloških pokazatelja izloženosti metalima.2 S obzirom da ne postoje podaci o koncentracijama MT u kukaša, u ovom istraživanju su određene razine MT u dvije vrste kukaša (Pomphorynchus laevis Müller, Acanthocephalus lucii Müller) te organizmima uključenim u njihov životni ciklus, međudomadaru rakušcu (Gammarus fossarum Koch) i konačnom domadaru ribi (klen, Squalius cephalus L.). Koncentracije MT u sve tri skupine organizama su određene diferencijalnom pulsnom voltametrijom (DPV), modificiranom metodom po Brdički, koja se primjenjuje za određivanje proteina koji sadrže tiolne skupine. Ova metoda je izabrana jer omogućava visoku osjetljivost i točnost mjerenja te jednostavnost pripreme uzoraka koje je potrebno toplinski obraditi kako bi se dobio uzorak obogaćen MT kao toplinski stabilnim proteinima. Zbog navedenih prednosti i relativno jeftine provedbe, DPV metoda po Brdički od 1980-tih ima široku primjenu u istraživanjima okoliša. Mjerenje je provedeno na 797 Computrace (Metrohm) uređaju s troelektrodnim sustavom (radna elektroda (viseća živina kap), protuelektroda (platinska žica) i referentna elektroda (Ag/AgCl/3M KCl)) u amonijačnoj otopini kobaltove(III) soli (1M NH4Cl + 1M NH4OH, pH=9, 5 i 610-4 M Co(NH3)6Cl3). Prije mjerenja iz otopine je potrebno ukloniti kisik propuštanjem dušika visoke čistoće i termostatirati ćeliju na 20°C te podesiti sljedeće mjerne parametre: početni/završni potencijal: -0, 9/-1, 65V ; amplituda/trajanje naponskog pulsa: 0, 02502V/0, 057s ; vrijeme ponavljanja pulsa: 0, 5s ; brzina promjene potencijala: 0, 005Vs-1. Brdičkina metoda se temelji na određivanju visine katalitičkog vala vodika pri potencijalu Ep = -1, 48 V, koji je proporcionalan koncentraciji proteina koji sadrže tiolne skupine, uključujući MT.3 Kao kalibrant je korišten MT zečje jetre (MT- 95-P, Ikzus Proteomics) otopljen u 0, 25 M NaCl. Na temelju toplinske stabilnosti, MT su određeni u toplinski obrađenom staničnom citosolu koji je odvojen iz tkiva kukaša, rakušaca i probavila klenova nakon homogeniziranja, centrifugiranja na 50000g te toplinske obrade na 85°C.4 Usporedba koncentracija MT, biomarkera izloženosti metalima, u kukaša i organizama uključenih u njihov životni ciklus opada u nizu (mg g-1 mokre mase): klen (2, 9) > kukaši (1, 8) > rakušci (1, 4). Iako je uočeno da kukaši akumuliraju puno više koncentracije metala od tkiva riba i drugih indikatorskih organizama, njihove koncentracije MT su ipak niže od koncentracija MT u probavilu riba u vodnom okolišu karakteriziranom kao slabo opterećenom metalima.

kukaši; rakušci; ribe; esencijani/toksični metali; metalotioneini

nije evidentirano