hrvatski

Kinetička karakterizacija enzima NADH oksidaze iz mikroorganizma Lactococcus lactis i regeneracija koenzima NAD+

NAD+/NADH-ovisne oksidoreduktaze su od sve većeg interesa u području biotransformacija, ali im je primjena ograničena jer za svoje djelovanje zahtijevaju koenzim. Koenzim je skup i mora se dodavati u stehimetrijskoj količini da bi reakcija išla u određenom smjeru. Kako bi se riješio taj problem, razvijene su mnoge metode regeneracije koenzima. Cilj ovog rada bilo je provesti regeneraciju koenzima NAD+ kataliziranu enzimom NADH oksidazom iz mikroorganizma Lactococcus lactis. Djelomično pročišćen enzim je korišten za ispitivanje aktivnosti na različitim temperaturama i pri različitim pH vrijednostima. Rezultati pokazuju da je najveća aktivnost enzima pri pH 5, 5 i temperaturi 50 °C. Enzim je kinetički karakteriziran. Provedeni su eksperimenti oksidacije NADH katalizirani enzimom NADH oksidazom u kiveti spektrofotometra pri tri različite pH vrijednosti, 7, 0, 8, 6 i 9, 0 i na temelju dobivenih rezultata procijenjeni su parametri Michaelis-Menteničine kinetike. Najbolji rezultati dobiveni su pri pH 7, 0, a procijenjeni parametri iznose Vm = 0, 656 U cm- 3, KmNADH = 0, 0065 mmol dm-3. Provedeni su eksperimenti oksidacije L-metionina katalizirani L-fenilalanin dehidrogenazom iz Rhodococcus sp. uz regeneraciju koenzima kataliziranu NADH oksidazom iz Lactococcus lactis. S obzirom da je ravnoteža ove reakcije vrlo nepovoljna, regeneracija koenzima je nužna da bi se ravnoteža pomaknula u desno prema većoj konverziji supstrata. Provedeni su eksperimenti s otopinom enzima nakon razbijanja stanica i centrifugiranja, te sa djelomično pročišćenim enzimom. U prvom eksperimentu postignuta je 80 %- tna konverzija L-metionina, a u drugom eksperimentu sa djelomično pročišćenim enzimom 100 %-tna konverzija L- metionina u 2-okso-4- metiltiomaslačnu kiselinu, na temelju čega se može zaključiti da je regeneracija koenzima uspješno provedena jer je ravnoteža reakcije pomaknuta u željenom smjeru. Rezultati su pokazali da volumna aktivnost oba enzima tijekom eksperimenta lagano pada. Procijenjene su konstante inaktivacije oba enzima korištenjem kinetičkog modela za inaktivaciju prvog reda te iznose: kd = 0, 012 h-1 za enzim L-fenilalanin dehidrogenazu, a za NADH oksidazu kd = 0, 005 h-1.

regeneracija koenzima ; NADH oksidaza ; L-fenilalanin dehidrogenaza ; NAD+

nije evidentirano