hrvatski

Uloga tumorskog supresora p53 u fenotipu Rpl24 heterozigotnih miševa

Cilj istraživanja: Testirati izražaj p53 u Rpl24-heterozigotnim miševima. Ukoliko je tumor supresor p53 izražen, testirati njegovu ulogu u fenotipu Rpl24-heterozigotnih miševa te odrediti molekularne mehanizme putem kojih p53 uzrokuje patološki fenotip Rpl24-heterozigotnih miševa. Materija i metode: U istraživanju je korišten miš s heterozigotnom mutacijom u genu za ribosomalni protein l24 (Rpl24) koja je nastala spontano, a koja rezultira specifičnim fenotipom ovih miševa: sljepoćom, abnormalnosti skeleta, smanjenom masom i zavijenim repom (Bst, engl. Belly Spot and Tail). Izražaj p53 utvrđen je imunohistokemijski i westernskom analizom u različitim razvojnim stadijima miševa Rpl24Bst/+. Korištenjem imunohistokemije analizirani su stanični ciklus nakon ugradnje 5-BrdU i apoptoza (prisutnost aktivirane kaspaze 3). Genska inaktivacija p53 ili p21 korištena je u analizi utjecaja ovih molekula na patološki fenotip miševa Rpl24Bst/+. Izražaj Rpl24 utvrđen je nakon izolacije RNA ili proteina northernskom ili westernskom analizom. Ciljne mRNA i miRNA koje su transkripcijski ovisne o p53 identificirane su korištenjem kvantitativne reakcije lančanom polimerazom (PCR, engl. polymerase chain reaction) i DNA nizova nakon izolacije RNA i sinteze komplementarne DNA (cDNA, engl. complementary DNA). Rezultati: Predloženo je da je patološki fenotip Rpl24-heterozigotnih miševa posljedica pogreške u sintezi ribosoma. U ovom radu sam pokazala da je p53 izražen u specifičnim stadijima embrionalnog razvoja miševa Rpl24Bst/+ . Za razliku od toga, mutacija Rpl24Bst/+ ne aktivira p53-ovisni kontrolni mehanizam u odraslih miševa što bi moglo biti posljedica normalne razine Rpl24 u stanicama, iako je razina mRNA za Rpl24 snižena slično kao u embrijima. Genska inaktivacija p53 gotovo u potpunosti sprječava razvoj patološkog fenotipa Bst. Nasuprot tome, preživljavanje Rpl24Bst/+ ; p53-/- je značajno smanjeno. Analizom p53-ovisnih mRNA i miRNA utvrđeno da su većina mRNA i miRNA čiji izražaj je poremećen u embrijima Rpl24Bst/+ uključene u regulaciju apoptoze. Analiza apoptoze u neuralnim tkivima embrija ukazala je na njenu ovisnost o statusu p53. Nadalje, p53- i Bax-ovisna apoptoza u pretečama melanocita vjerojatno dovodi do smanjenja broja tih stanica te pojave bijele pjege na trbuhu miševa Rpl24Bst/+. Normalan pupilarni refleks na svjetlo nakon inaktivacije p53 ukazuje da je i ovaj fenotip ovisan o p53 unatoč tome što ni p53 ni apoptoza nisu bili aktivirani u retinama embrija Rpl24Bst/+ . Prisutnost apoptoze u nedostaku poremećaja diobe stanica u repovima embrija Rpl24Bst/+ ukazuje da zavijen rep u Rpl24-heterozigotnih miševa može biti posljedica aktivacije apoptoze. Zaključci: Pogreška u sintezi ribosoma uzrokovana smanjenim izražajem Rpl24 u Rpl24-heterozigotnim miševima dovodi do aktivacije tumorskog supresora p53 koji putem regulacije svojih transkripcijskih ciljeva dovodi do razvoja fenotipa Bst. Ovi rezultati ukazuju da p53 regulira morfološki fenotip Rpl24-heterozigotnih miševa putem p21-neovisnih mehanizama kao što je npr. apoptoza. Suprotno tome, p53 regulira preživljavanje ovih miševa barem djelomično putem p21-ovisnog mehanizma.

apoptoza; dioba stanice; kontrolni mehanizam ovisan o p53; nedostatak ribosomalni proteina; rast stanice; ribosom; ribosomalni protein l24

nije evidentirano