hrvatski

Kloniranje i ekspresija različitih varijanti HP1326 iz bakterije Helicobacter pylori

Patogena bakterija Helicobacter pylori je predmet brojnih istraživanja zbog izuzetne sposobnosti preživljavanja u uvjetima niskog pH kakav vlada u želučanoj sluznici čovjeka. Jedni od proteina koji joj omogućuju preživljavanje su proteini važni za održavanje homeostaze metalnih iona. CrdA (HP1326) je protein koji zajedno s proteinima CrdB (HP1327) i CzcB sudjeluje u regulaciji razine bakrovih iona u citoplazmi [1]. S ciljem priređivanja proteina CrdA za kristalizaciju uklonirani su različiti genski konstrukti. Za kloniranje su korišteni vektori pETite C-His i pETite N-Strep (linearizirani vektori) te pGEX-6-P1 (cirkularni vektor) s restrikcijskim mjestom za Prescission proteazu. Različiti konstrukti proteina CrdA su prekomjerno eksprimirani u kulturi bakterijskih stanica E. coli BL21(DE3) pri različitim temperaturama (301 K, 289 K). Optimalna ekspresija proteina dobivena je pri nižoj temperaturi, međutim u slučaju CrdAHis6 i StrepCrdA dobivene su velike količine proteina u obliku inkluzijskih tijela (provedena je renaturacija) dok je GSTCrdA prekomjerno eksprimiran s velikim udjelom proteina u topljivim frakcijama. Različite varijante rekombinantnog proteina su nadalje pročišćene afinitetnom kromatografijom i gel filtracijom. Kvaliteta uzorka za kristalizaciju ispitana je DLS-om koji je ukazao na polidisperznost uzorka dok je dodatak deterdženta i bakrovih iona povećao monodisperznost uzorka. Literatura: [1] B. Waidner, K.Melchers, I. Ivanov, H. Loferer, K. W. Bensch, M. Kist and S. Bereswill, J. Bacteriol. 184 (2002) 6700-6708.

kloniranje; H. pylori; HP1326

nije evidentirano