hrvatski

Uloga nukleazne aktivnosti enzima RecBCD u naivnoj i pripremljenoj ugradnji razmaknica i vijabilnosti bakterije Escherichia coli

Sustav CRISPR-Cas ( od eng. clustered regularly interspaced short palindromic repeats i CRISPR associated) bakterijski je mehanizam obrane od stranih genetičkih elemenata. Sustav se sastoji od lokusa CRISPR u koji se ugrađuju razmaknice stranog podrijetla između ponavljajućih sljedova, te pridruženih proteina Cas. Sustav CRISPR-Cas predstavlja adaptivni imunološki odgovor koji se odvija u tri koraka. U prvom koraku zvanom adaptacija dolazi do ugradnje strane DNA u obliku razmaknice i sinteze dodatnog ponavljajućeg slijeda. Adaptacija se odvija, ovisno o proteinima Cas koji i njoj sudjeluju, na dva načina - kao naivna ili pripremljena. Proteini Cas1 i Cas2 su neophodni u oba načina. U ovom radu istražen je utjecaj nukleazne aktivnosti enzima RecBCD (mutanti recB i recD) na naivnu i pripremljenu ugradnju, te na vijabilnost, odnosno stabilnost plazmida u bakteriji Escherichia coli. Potvrdili smo ključnu ulogu nukleazne aktivnosti enzima RecBCD u naivnoj adaptaciji. U pripremljenoj adaptaciji nukleazna aktivnost enzima RecBCD nije neophodna, ali efikasnost ugradnje razmaknice je znatno manja i ovisi o broju stanica što nije slučaj u stanicama divljeg tipa. Ekspresija gena cas1 i cas2 s plazmida nije utjecala na vijabilnost istih mutanata, ali je za 1000 puta smanjila udio stanica s plazmidom u dvostrukom mutantu recD recJ. Genetičkom analizom pokazali smo da gubitak plazmida ovisi o kompleksu Cas1-Cas2. Diskutirani su mogući razlozi ovog efekta.

CRISPR-Cas, naivna ugradnja, pripremljena ugradnja, RecBCD, vijabilnost

nije evidentirano