hrvatski

Karakterizacija biljnih dipeptidil-peptidaza III s potencijalnom dualnom aktivnošću

Dipeptidil-peptidaza III (DPP III) je metalopeptidaza s pretpostavljenom ulogom u katabolizmu proteina. Homolozi DPP III pronađeni su u genomima svih kopnenih biljaka. Biljni homolozi DPP III su atipični zbog prisutnosti dodatne domene na N-kraju i atipičnog motiva aktivnog mjesta DPP III domene. Aktivno mjesto DPP III specifično je zbog prisutnosti HEXXXH heksapeptida, koji je jedinstven za ovu porodicu peptidaza. Biljni homolozi, naprotiv, sadrže očuvan HEXXH motiv, koji se može naći u drugim metalopeptidazama. Da bismo potvrdili predviđanje da ovi proteini pokazuju DPP III enzimsku aktivnost, pripremili smo i biokemijski okarakterizirali heterologno eksprimirane rekombinantne proteine iz dviju modelnih biljaka: mahovine (Physcomitrella patens) kao predstavnika nižih biljaka i uročnjaka (Arabidopsis thaliana) kao predstavnika viših biljaka. Enzimskim testom potvrdili smo DPP III aktivnost, koja je najniža dosad zabilježena za proteine iz ove porodice. Da bismo pokušali utvrditi uzrok vrlo male enzimske aktivnosti, ciljanom mutagenezom pripremili smo mutante sa heksapeptidnim motivom aktivnog mjesta, i fragment bez dodatne domene na N-kraju. Pripremljeni mutanti pokazivali su još manju DPP III aktivnost. Dodatna domena, koja pripada porodici proteina sličnih Nudix-hidrolazama, nije prisutna u DPP III iz prokariota i ostalih eukariota. Bioinformatičkom analizom previđeno je da bi ova domena mogla biti Nudix-hidrolaza tj. djelovati kao fosfataza na nukleotid-difosfate, no nije bilo poznato što bi mogli biti potencijalni supstrati. Dodatna bioinformatička analiza predvidjela je da je riječ o izopentenil-difosfat-izomerazi (IDI). Proveli smo ispitivanje IDI aktivnosti pomoću testa komplementacije boje u bakteriji Escherichia coli, kojim pokazujemo da ovi enzimi nisu izopentenil-difosfat-izomeraze. Naprotiv, naši rezultati pokazuju da bi Nudix-DPP III proteini iz biljaka mogli djelovati kao fosfataza izopentenil-difosfata (IPP) ili njegovog izomera. Naši budući eksperimenti biti će usmjereni na utvrđivanje potencijalne aktivnosti ovih proteina kao Nudix-hidrolaza te moguće interakcije Nudix i DPP III domena.

dipeptidil-peptidaza III ; Nudix hidrolaza ; izopentenil-difosfat-izomeraza

nije evidentirano