hrvatski

Generiranje vektora za ugradnju reporter gena u genom herpes simpleks virusa 1

Razvojem BAC mutageneze otvoren je novi put manipulacije velikih genoma virusa, uključujući Herpesviridae. Stabilnost, lakoća manipulacije i veliki kapacitet BAC vektora unutar Escherichie Coli označili su prekretnicu omogućivši različite modifikacije, od točkastih mutacija, do insercije i delecije virusnih ili stranih gena. Kako bi imali bolji uvid u replikaciju HSV-1 i njegovo širenje tijekom infekcije, in silico i metodama molekularnog kloniranja, konstruirali smo rekombinantni virus u kojem je EGFP (engl. enhanced green fluorescent protein) ekspresijska kazeta ugrađena u intergensku regiju između sekvenci UL3 i UL4. En passant mutagenezom, jednostavnom i efikasnom lambda Red rekombinacijskom tehnikom, generirali smo HSV-1 EGFP rekombinantni virus u dva ključna koraka. U prvom koraku, linearizirani transfer konstrukt vektora pInserter-MCS (ApaI/NotI, ApaI/SacII) integriran je Red rekombinacijom u ciljno mjesto pozitivnom selekcijom na kanamicin (LD- pIns-KAN, LD-pIns). U drugom koraku, I-SceI endonukleaza cijepa mjesto prepoznavanja stvarajući dvostruke lomove DNA (engl. double strand brakes, DSB). Susjedne duplicirane sekvence, prisutne na krajevima dsDNA, služe kao novi substrat za drugu Red rekombinaciju, koja rezultira gubitkom kanamicina (LD-EGFP- KAN, LD-EGFP). Uspješnost ugradnje EGFP ekspresijske kazete u genom HSV-1 potvrdili smo metodom fluorescentne mikroskopije i Western blot analizom. HSV-1 EGFP inficirane stanice i bez prisustva promotora emitiraju dovoljnu razinu fluorescencije potrebne za praćenje virusne repliakcije in vitro. Odmicanjem od središta virusnog plaka, gdje je EGFP autofluorescencija inficiranih stanica najjače izražena, fluorescencija značajno opada. Ovim radom uspostavili smo jednostavan i izravan sustav kontinuiranog praćenja HSV-1 infekcije in vitro, te otvorili mogućnost njegove primjene i na druge HSV-1 sojeve. Daljni napori našeg laboratorija biti će usmjereni ka adaptaciji vektora pInserter-MCS za primjenu miRNA „sponge“ tehnologije kojom bi se razjasnila uloga miRNA u virulenciji.

HSV-1 (herpes simpleks virus 1), lambda Red rekombinacija, pInserter-MCS

nije evidentirano