hrvatski

Konformacijske promjene alkalne fosfataze iz bakterije Escherichia coli u ovisnosti o sadržaju metalnih iona

Alkalna fosfataza (AP; E.C. 3.1.3.1.) iz bakterije Escherichia coli (AP) je homodimerni metaloenzim koji sadrži dva vezna mjesta za Zn2+ i jedno za Mg2+ u svakom aktivnom mjestu. AP pokazuje odstupanja od Michaelis-Menten kinetike koja su tumačena negativnom kooperativnošću odnosno modelom dimernog enzima s nejednakim podjedinicama. Pretpostavlja se da su promjene konformacije izazvane vezanjem iona metala odgovorne za izražaj negativne kooperativnosti odnosno opaženu asimetriju enzima. U ovom radu proučene su konformacijske promjene AP ovisne o metalnim ionima. Promoću ograničene proteolize tripsinom, utvrđeno je da je vezanje Zn2+ popraćeno značajnim povećanjem otpornosti na proteolitičku razgradnju. Analiza triptičkih fragmenata MALDI-TOF masenom spektrometrijom ukazala je na specifičnu zaštitu peptidne veze iza Arg-293, koja postaje manje dostupna za proteolitičko cijepanje uslijed konformacijskih promjena koje se prenose preko dodirne površine podjedinica. Da bi se dobio ekspresijski sustav koji omogućava usmjerenu mutagenezu i pročišćavanja mutiranih enzima, gen za AP phoA je umnožen lančanom reakcijom polimerazom iz genomske DNA i ugrađen u pET ekspresijski vektor. Povećana proizvodnja AP je potvrđena analizom ukupnih staničnih proteina i mjerenjem aktivnosti AP u uzgojnom mediju.

alkalna fosfataza; konformacijske promjene; ograničena proteoliza; MALDI

nije evidentirano