hrvatski

Validacija metode za genotipizaciju polimorfizama S290N, V599L i T715P u genu za P- selektin primjenom metode PCR-HRM

Uvod: P-selektin (PSEL) je adhezijska molekula trombocitne membrane koja ima ključnu ulogu u agregaciji i pokretanju trombocita prema mjestu vaskularne ozljede. Polimorfizmi S290N, V599L i T715P u genu PSEL mogu biti uzrok hiperkoagulabilnosti. Do sada smo za analizu ovih polimorfizama primjenjivali vremenski zahtjevan alel-specifičan PCR (PCR-SSP) u kojem se koristi 150 ng kalupa DNA i elektroforeza umnoženih produkata na agaroznom gelu. Svrha ovog istraživanja bila je validacija nove brže metode za genotipizaciju zasnovane na PCR-u u stvarnom vremenu analizom krivulje taljenja visoke razlučivosti (PCR-HRM) koja zahtijeva svega 10 ng kalupa DNA. Materijali/Ispitanici i metode: DNA je izolirana iz uzoraka krvi ispitanika prikupljenih u sklopu projekta HRZZ IP-2014-09- 2047 metodom isoljavanja. Početna genotipizacija polimorfizama S290N, V599L i T715P u genu PSEL učinjena je metodom PCR-SSP te je poslužila kao referentna metoda u određivanju analitičke osjetljivosti. Genotipizacija primjenom metode PCR-HRM izvedena je na uređaju LightCycler 480 (Roche, Njemačka) pomoću početnica za polimorfizam T715P iz literature, a za preostale polimorfizme konstruiranih pomoću alata Primer- BLAST. Ponovljivost i međupreciznost određene su za svaki polimorfizam odabirom triju uzoraka različitih genotipova. Za određivanje točnosti, analitičke osjetljivosti i specifičnosti odabrano je za svaki polimorfizam po 20 uzoraka divljeg tipa, 10 uzoraka heterozigota i 10 uzoraka homozigota. Svi rezultati izraženi su kao postotak slaganja uz kriterij prihvatljivosti ≥ 95 %. Rezultati: 100-postotno slaganje rezultata dobiveno je prilikom ispitivanja ponovljivosti, međupreciznosti, točnosti i analitičke specifičnosti za sva tri polimorfizma te za određivanje analitičke osjetljivosti za polimorfizam S290N. Slaganje rezultata za ispitivanje analitičke osjetljivosti za polimorfizme V599L i T715P iznosilo je 90 %, ali je ponovljenom analizom provedenom objema metodama utvrđena pogrešna početna genotipizacija pomoću metode PCR-SSP, odnosno ispravnost genotipizacije metodom PCR- HRM. Zaključak: Validacijom PCR-HRM za genotipizaciju polimorfizama S290N, V599L i T715P u genu PSEL utvrđeno je da je metoda precizna, točna i specifična te brža i osjetljivija od PCR-SSP.

genotipizacija, analiza krivulje taljenja visoke razlučivosti, validacija metode, P-selektin, polimorfizam jedne baze

nije evidentirano