hrvatski

Začetak i smjer razvoja forenzične genomike u CFIIV "Ivan Vučetić"

Tehnologija masivnog paralelnog sekvenciranja (MPS) je revolucionarizirala sva područja temeljnih i primijenjenih znanosti kojima je u fokusu analiza sekvence nukleinskih kiselina. U tom smislu je potrebno unaprijediti vještačenje bioloških tragova prilagodbom naprednih metoda potrebama forenzike. Budući da nova tehnologija nema ograničenja u broju simultano analiziranih DNA biljega po uzorku, forenzični stručnjaci će u budućnosti biti suočeni sa sve kompleksnijim analizama. Stoga je CFIIV „Ivan Vučetić“ prepoznao važnost stasanja DNA stručnjaka nove generacije koji će ovladati eksperimentalnim protokolima, bioinformatičkim alatima za obradu podataka te interpretacijom rezultata u kontekstu predmeta vještačenja, s konačnim ciljem potpune implementacije MPS-a u rutinsku praksu. Prva implementirana metoda temeljena na MPS tehnologiji jest sekvenciranje humanog mitohondrijskog genoma iz visokokvalitetnih uzoraka krvi i oralnog epitela. Priprema biblioteka za sekvenciranje se temelji na tagmentaciji (enzimsko cijepanje uz dodavanje adapterskih oligonukleotida) mtDNA amplikona duljine 9, 1 i 11, 2 kb te PCR-u kojim se dodaju oligonukleotidi neophodni za sekvenciranje po sintezi (Nextera® XT Library Preparation, Illumina®). Biblioteke se procjenjuju kvantitativno i kvalitativno pomoću DNA High Sensitivity kita na instrumentu LabChip® GX Touch HT (PerkinElmer®), spajaju u jedinstveni uzorak te sekvenciraju pomoću MiSeq® Reagent v2 kita na MiSeqFGx® instrumentu (Illumina®). Za analizu podataka se koriste: Illumina® BaseSpace® aplikacije (mtDNA Variant Processor v.1.0 i mtDNA Variant Analyzer v.1.0), HaploGrep2 v.2.1.1 i PhyloTree Build 17. Sekvenciranjem 300 mtDNA nesrodnih hrvatskih državljana dobiveni su visokokvalitetni podaci (≥Q30 za >92% svih sekvenciranih baza), srednje pokrivenosti po uzorku 6512±910x. U hrvatskoj populaciji su najzastupljenije makro-haplogrupe H (36%) te U (23%) s podogrankom K (6%). Slijede makro-haplogrupe HV i V (10%), J (8%) i T (8%). Makro-haplogrupe D, R0, X, I, N1 i W imaju frekvencije u rasponu od 1-2%, dok je ogranak A zastupljen s jednim uzorkom. Frekvencije glavnih haplogrupa definiraju hrvatsku populaciju u kontekstu matrilineranog biljega kao tipično europsku. Neki od kandidata za prijedlog novih ogranaka u globalnom filogenetskom stablu mtDNA su pronađeni u haplogrupama I5, H47, H55b i U2e2a1d. Ukupno 28% uzoraka ima točkastu heteroplazmiju višu od 10%. Razvoj bioinformatičkog protokola za detekciju heteroplazmija ispod 10% je u tijeku. Ovim radom je formirana referentna zbirka sekvenci cijelih mtDNA genoma recentne hrvatske populacije, koja će se koristiti prvenstveno u svrhu statističke procjene učestalosti haplogrupa u predmetima vještačenja. Sekvence će biti pohranjene u globalnoj forenzičnoj bazi podataka mtDNA, čime će se nadmašiti postojeći broj profila dobivenih sekvenciranjem cijelih molekula mtDNA. Zbirka će također biti od nemjerljivog značaja za područja molekularne antropologije i molekularne medicine, osobito u lokalnom kontekstu.

masivno paralelno sekvenciranje ; mitohondrijska DNA ; populacijska studija ; forenzična baza podataka mtDNA

nije evidentirano