hrvatski

Utjecaj duljine molekule sgRNA na učinkovitost i specifičnost proteina Cas9 iz vrste Staphylococcus aureus

Sustav CRISPR/Cas9, adaptivni imunosni sustav prokariota, iskorišten je kao metoda za ciljano uređivanje genoma. Cas9 inaktiviran mutacijama (dCas9) može se koristiti za navođenje efektorskih domena. Ciljani gen moguće je metilirati korištenjem fuzije dCas9-DNMT3A, ili demetilirati sa dCas9-TET1. Problem ovakvih sustava je nespecifična aktivnost izvan ciljnih lokusa, što se može smanjiti korištenjem skraćenih sgRNA. Cilj istraživanja bio je utvrditi utjecaj različitih duljina sgRNA na specifičnost sustava za ciljanu promjenu statusa metilacije DNA. Ekspresijske kazete za sgRNA klonirane su u vektore za koekspresiju dCas9- DNMT3A, odnosno dCas9-TET1, kojima je transfecirana stanična linija HEK293. Nakon transfekcije stanična DNA je izolirana te pirosekvencirana nakon bisulfitne konverzije radi određivanja metilacijskog statusa. Skraćivanje molekula sgRNA nije dovelo do statistički značajnog smanjenja nespecifične aktivnosti. Nije utvrđen veći utjecaj skraćivanja molekula sgRNA na nespecifičnu aktivnost u odnosu na specifičnu aktivnost. Optimalna duljina molekule sgRNA za ciljanje gena LAMB1 i fragment F3 gena BACH2 je 21 nukleotid te 20 nukleotida za fragment F4 gena BACH2 i fragment A1 promotora gena MGAT3.

dCas9 ; DNMT3A ; TET1 ; modificiranje epigenoma ; HEK293 ; metilacija

nije evidentirano