Aldolaze su važna skupina enzima za sintezu ugljikohidrata i drugih složenih produkata1. Sudjeluju u anabolizmu i katabolizmu gotovo svih organizama, te u esencijalnim biosintetičkim putevima ugljikohidrata, ketokiselina i aminokiselina2. Pripadaju u skupinu liaza i kataliziraju stvaranje C-C veze3. Do stvaranja veze ugljik-ugljik dolazi i u reakciji proučavanoj u ovom radu, a radi se o reakciji aldolne adicije dihidroksiacetona (DHA) na N-Cbz-3-aminopropanal (aldehid) kataliziranoj fruktozom-6-fosfat aldolazom (FSA A129S) dobivenom iz genetski modificirane Escherichia coli. Ispitan je utjecaj N-Cbz-3-aminopropanala na početnu brzinu reakcije aldolne adicije, te utjecaj ovog aldehida na stabilnost enzima. Aldolni produkt ove reakcije je značajan jer se koristi kao prekursor u proizvodnji fagomina, prirodnog iminošećera sa značajnim biološkim svojstvima4. Ispitan je utjecaj pH na aktivnost aldolaze, te je određena kinetika reakcije pri optimalnom pH. Aldolna adicija je provedena u kotlastom reaktoru, te je ispitana stabilnost enzima u ponovljivim šaržnim eksperimentima. Rezultati pokazuju da povećanjem koncentracije aldehida dolazi do porasta početne brzine reakcije, te da ne dolazi do inhibicije supstratom. Stoga su ovi podaci opisani Michaelis- Menteničinom kinetikom, te su procijenjene vrijednosti kinetičkih parametara modela. Kinetički parametri ukazuju na visoku aktivnost aldolaze (Vm), te na slab afinitet enzima prema supstratu (velika vrijednost Km). Ispitivanjem utjecaja različitih koncentracija aldehida (0, 20, 250 mM) na aktivnost aldolaze je pokazano da ovaj aldehid nema negativan učinak na stabilnost enzima. Tijekom vremena je praćena aktivnost enzima pomoću enzimskog testa, te su iz ovisnosti aktivnosti enzima o vremenu procijenjene konstante brzine deaktivacije enzima prvog reda. Enzim je pokazao najmanju stabilnost u čistom puferu gdje je procijenjena najviša vrijednost konstante brzine deaktivacije. Manja stabilnost enzima u čistom puferu upućuje na zaključak da prisustvo supstrata ima stabilizirajući učinak na enzim. U kotlastom reaktoru je postignuta ravnotežna konverzija od oko 80 %. Pokazalo se da tijekom tri šaržna eksperimenta u kojima je korištena ista frakcija enzima, aldolaza nije izgubila aktivnost. 1 Calveras et al., Tetrahedron, 2006, 62, 2648- 2656 2 Ferrara et al., Biochim. Biophys. Acta, 2011, 1814, 622–629 3 Lopez-Santin et al, Illanes ed., Springer, 2008, 333 – 352 4 Castillo et al, Org. Lett. 2006, 8, 6067-6070

Biotehnologija